長(zhǎng)鏈非編碼 RNA EVADR 促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖及遷移

韓 丹，童亞楠，賈銀平，唐夢(mèng)靈，曹劉素，張竹君，潘 渠

(1.成都醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室， 四川 成都 610500；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué)) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物及免疫學(xué)教研室， 重慶 400038)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大癌位居癌相關(guān)死亡原因的第二。腫瘤的復(fù)發(fā)且發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗和死亡的主要原因[1- 2]。大量研究證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程里發(fā)揮了十分重要的作用。其中長(zhǎng)度為379 bp，位于人 6 號(hào)染色體的lncRNA EVADR 是與結(jié)直腸癌有密切相關(guān)性的 lncRNA。值得注意的是 EVADR 的高表達(dá)提示預(yù)后不良，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[3]。而 lncRNA EVADR 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建過(guò)表達(dá) EVADR 的結(jié)直腸癌細(xì)胞通過(guò)利用慢病毒技術(shù)，觀察其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)及參與調(diào)節(jié)分子表達(dá)的影響，深入探討結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中 EVADR 的潛在作用機(jī)制，為結(jié)直腸癌的早期診斷和治療提供科學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和包裝(上海漢恒生物科技有限公司)；嘌呤霉素；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)；Primer Script RT Reagent Kit (TaKaRa公司)；SYBR-GREEN Real-time PCR MIX (Toyobo公司)；Trizol(Invitrogen公司)； ECL Western blot substrate (Pierce公司)；PVDF 膜(GE公司)；兔抗 E-cadherin (24E10) 和兔抗 β-actin(Cell Signaling公司)；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Transwell小室(BD 公司)；CCK- 8試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)。

1.1.2 細(xì)胞：人結(jié)直腸癌細(xì)胞系 HCT116 和 LOVO(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.2 方法

1.2.1 HCT116和LOVO 細(xì)胞的培養(yǎng)與慢病毒感染：人結(jié)直腸癌 HCT116和LOVO細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。取增生至對(duì)數(shù)期的 HCT116和LOVO細(xì)胞，分別按 1×105個(gè)/孔接種于24孔板，待細(xì)胞匯合率為50%左右，加入MOI=15病毒液同時(shí)加入終濃度為6 mg/L的Polybrene，感染24 h后更換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，感染48 h后加入1 mg/L的 Puromycin 篩選7 d，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置：HCT116-EVADR和LOVO-EVADR (轉(zhuǎn)染lncRNA EVADR的靶向組)，HCT116-NC和LOVO-NC (轉(zhuǎn)染GFP的陰性對(duì)照組)。

1.2.2 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將 HCT116、LOVO兩組(NC組和EVADR組)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞按 3×105個(gè)/孔接種 96 孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為：37 ℃、5% CO2、95%濕度，24 h后分別在培養(yǎng)孔加入 10 μL CCK- 8 檢測(cè)試劑，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度于A450處，以吸光度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.3 Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力：將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 HCT116、LOVO兩組(NC組和EVADR組)細(xì)胞以 1×105個(gè)/孔加入孔徑為 8 μm的Transwell小室，用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)。其上層小室培養(yǎng)液加入不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基，下層小室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)18 h后，將上下室培養(yǎng)基吸盡，棉簽干凈擦拭上室細(xì)胞。10% 甲醛固定細(xì)胞后用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡250倍下分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞均數(shù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)lncRNA EVADR和間質(zhì)化標(biāo)志物 Snail、Slug、ZEB1和ZEB2的表達(dá)：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后檢測(cè)兩組細(xì)胞(NC組和EVADR組) lncRNA EVADR表達(dá)水平。Trizol 收集2組細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有反應(yīng)均重復(fù)3次。用SYB Green染料法檢測(cè)lncRNA表達(dá)水平，總反應(yīng)體系10 μL(SYBR Green 5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板2 μL，DEPC-H2O 2 μL)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量 PCR引物用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，于上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)引物見(jiàn)表 1。lncRNA EVADR的表達(dá)水平以 2-△△Ct計(jì)算，以 β-actin作為內(nèi)參。

表1 EVEDR、Snail、 Slug、 ZEB1、 ZEB2 real time-PCR引物

1.2.5 Western blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá)：收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 HCT116和LOVO兩組(NC組和EVADR組)細(xì)胞于冰上用冷PBS液清洗細(xì)胞3次，加入蛋白酶抑制劑，離心后棄除沉淀，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。加入上樣緩沖液后，98 ℃蛋白變性 5 min；8% SDS-PAGE 膠電泳，用濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液室溫環(huán)境下封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜(稀釋倍數(shù)：E-cadherin 1∶10 000，β-actin 1∶1 000)，二抗室溫 1.5 h (稀釋倍數(shù)：1∶4 000)。在化學(xué)與熒光成像儀下加ECL發(fā)光液曝光，結(jié)果處理用Image Lab 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染 HCT116和LOVO細(xì)胞

慢病毒感染 HCT116和LOVO細(xì)胞3 d后，熒光顯微鏡下觀察，干擾效率大于90%(圖1)。感染 HCT116和LOVO的最佳 MOI 值為15。

HCT116 cells infected with EVEDR-GFP lentivirus in fluorescence images (A) and microscopy images (B); LOVO cells infected with EVEDR-GFP lentivirus in fluorescence images (C) and microscopy images (D)圖1 慢病毒感染HCT116，LOVO細(xì)胞的熒光強(qiáng)度Fig 1 Fluorescence intensity of HCT116 and LOVO cells after lentivirus infection (×40)

2.2 慢病毒感染細(xì)胞后對(duì) lncRNA EVADR 表達(dá)的影響

blank.no lentivirus infection; lentivirus control.NC-lentivirus infection; lentivirus EVEDR.EVEDR-lentivirus infection; *P<0.05 compared with blank and lentivirus control group圖2 qPCR驗(yàn)證HCT116細(xì)胞和LOVO細(xì)胞中EVEDR的過(guò)表達(dá)效果Fig 2 Effect of overexpression of lncRNA EVEDR after lentivirus infection by qPCR (±s, n=3)

與 HCT116-NC和LOVO-NC相比，HCT116-EVADR和LOVO-EVADR中l(wèi)ncRNA EVADR表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 lncRNA EVADR對(duì)HCT116和LOVO細(xì)胞增殖能力的影響

與 HCT116-NC和LOVO-NC細(xì)胞組對(duì)比，HCT116-EVADR和LOVO-EVADR細(xì)胞組增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.001)(圖3)。

2.4 lncRNA EVADR對(duì) HCT116和LOVO細(xì)胞遷移能力的影響

HCT116和LOVO細(xì)胞過(guò)表達(dá)lncRNA EVADR后，與HCT116-NC和LOVO-NC細(xì)胞組對(duì)比，HCT116-EVADR和LOVO-EVADR細(xì)胞組穿過(guò)Transwell微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)(圖4)。

2.5 過(guò)表達(dá) lncRNA EVADR可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT發(fā)生

與 HCT116-NC和LOVO-NC細(xì)胞組對(duì)比，HCT116-EVADR和LOVO-EVADR細(xì)胞組中上皮化標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯減少(圖5)，而間質(zhì)化標(biāo)志物Snail、Slug、ZEB1 和 ZEB2表達(dá)增多(圖6)。

The effect on proliferation of HCT116 cells(A) and LOVO cells(B);*P<0.001 compared with lentivirus control圖3 過(guò)表達(dá)lncRNA EVEDR對(duì)HCT116細(xì)胞和LOVO細(xì)胞增值的影響Fig 3 Effect of lncRNA EVEDR overexpression on proliferation of HCT116 cells and LOVO cells (±s, n=6)

The transwell cell assay of HCT116 cells(A) and LOVO cells(B);*P<0.001 compared with lentivirus control圖4 Transwell 小室檢測(cè)過(guò)表達(dá)lncRNA EVEDR后HCT116細(xì)胞和LOVO細(xì)胞遷移能力

the expression level of E-cadherin in EVEDR-Lentivirus infection group of HCT116 cells(B) and LOVO cells(D) were lower than NC-Lentivirus infection group of HCT116 cells(A) and LOVO cells(C);*P<0.05 compared with lentivirus control

The relative mRNA level of BMT transcription factors in HCT116 cells(A) and LOVO cells(B); *P<0.05 compared with lentivirus control

3 討論

中國(guó)每年新增結(jié)直腸癌患者高達(dá)33萬(wàn)例，死亡人數(shù)就有16萬(wàn)例。其中20%的患者確診時(shí)因?yàn)橐殉霈F(xiàn)轉(zhuǎn)移而失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，約有50%的患者術(shù)后第2年就因?yàn)槟[瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而死亡[4]。因此，闡明結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)其早期診斷和綜合防治具有重要的臨床意義。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn) lncRNA在結(jié)直腸癌中起著重要的調(diào)控作用，其有望成為新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200 nt的非蛋白編碼RNA，占到非編碼 RNA的80%以上[5- 6]。在前期研究中，本研究收集25例結(jié)直腸癌患者臨床標(biāo)本，采用高通量基因芯片檢測(cè)分析腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn) EVADR差異最為顯著。已有報(bào)道表明EVADR與結(jié)直腸癌密切相關(guān)，EVADR高表達(dá)提示預(yù)后不良，其表達(dá)水平與癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[3]。本研究通過(guò)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá) EVADR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與 HCT116-NC和LOVO-NC細(xì)胞組對(duì)比，HCT116-EVADR和LOVO-EVADR細(xì)胞組增殖和遷移能力均有不同幅度的增高，并且過(guò)表達(dá) EVADR 的結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮化標(biāo)志物 E-cadherin 表達(dá)明顯減少，而間質(zhì)化標(biāo)志物 Snail、Slug、ZEB1和ZEB2 表達(dá)增多。E-cadherin 表達(dá)的降低標(biāo)志細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化(EMT)，腫瘤分化程度低，并且更加容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示患者預(yù)后不良[7- 9]，而 lncRNA是從Snail和Slug基因的下游區(qū)域產(chǎn)生，可增加這兩種 EMT 誘導(dǎo)物的表達(dá)[10]。這就表明，lncRNA EVADR很有可能通 EMT調(diào)節(jié)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移。

上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT 時(shí)，細(xì)胞基質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和細(xì)胞間的連接黏附成分均會(huì)降低，細(xì)胞骨架的重構(gòu)蛋白明顯增多[7- 8]。已有研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種 lncRNA 通過(guò)靶向 Snail、ZEB 和Twist 等轉(zhuǎn)錄因子以及E-cadherin 等重要的細(xì)胞連接蛋白來(lái)調(diào)控 EMT的發(fā)生和發(fā)展，HOTAIR在結(jié)直腸癌中促進(jìn)EMT進(jìn)程可能通過(guò)Snail，顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[11]，BANCR可能通過(guò)影響 MEK 信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞 EMT 作用[12]。此外，最新的結(jié)果表明被 TGF- β活化的lncRNA-ATB通過(guò)上調(diào)ZEB1和ZEB2，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的EMT并促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移[13- 14]，這些當(dāng)前的研究提供了非編碼RNA在上皮可塑性生物調(diào)解中起重要和復(fù)雜作用的證據(jù)，并且可以作為治療癌的潛在有效靶標(biāo)候選物。由于lncRNA種類(lèi)繁多，還有許多 EMT 相關(guān)lncRNA尚未被認(rèn)識(shí)和研究，在結(jié)直腸癌中的作用尚未闡明，深入研究 EMT 相關(guān) lncRNA 在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制，可以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和改善腫瘤治療。

總之，本研究結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá) lncRNA EVADR促進(jìn)了結(jié)直腸癌 HCT116、LOVO細(xì)胞的增殖和遷移，并且提示EVADR可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤的遷移作用。該結(jié)果為深入研究結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制提供了重要的線索。

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