小檗堿改善動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血管炎性反應(yīng)和鈣化

李曉明，王青竹，石 婧，鞠 瑞，朱 蕾，李 娟，郭 磊，葉菜英

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系，北京 100005)

隨著中國生活水平的提高，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)性疾病已躍居于人口死亡的主要原因之列。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的病因較為一致的看法是因脂質(zhì)代謝紊亂、炎性細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和平滑肌細(xì)胞激活等[1]，這些機(jī)制都不是獨(dú)立發(fā)揮作用的，而是相互滲透，因果循環(huán)的，最終導(dǎo)致斑塊的破裂，血栓形成，造成嚴(yán)重心腦血管疾病。

小檗堿(berberine，BBR)是一種從黃連中提取出來的中藥成分，一直以來廣泛用于胃腸炎和細(xì)菌性痢疾，近年來發(fā)現(xiàn)它是一種新型的降低膽固醇的藥物，它的作用機(jī)制雖然目前沒有解釋的非常清晰，但是與常用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的他汀類藥物不同。近年來對(duì)于小檗堿的降脂機(jī)制，最多的觀點(diǎn)是認(rèn)為小檗堿可以上調(diào)LDL受體的表達(dá)[2]。對(duì)于它緩解動(dòng)脈粥樣硬化的其他作用機(jī)制，尚未闡釋的十分明了。本文將從調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)和影響血管鈣化的角度對(duì)BBR的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：48只SPF級(jí)Apo-/-E雄性小鼠，6 ～8周，體質(zhì)量18 ～22 g[北京華阜康生物科技股份有限公司，SCXK(京)2014- 0004]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)和兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMCs)系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。

1.1.3 藥品及試劑：小檗堿(BBR)(Sigma公司)；TNF-α(Abcam公司)；IL- 6、血管細(xì)胞黏附分子- 1(vascular cell adhesion molecule- 1,VCAM- 1)、細(xì)胞間黏附分子- 1(intercellular cell adhesion molecule- 1,ICAM- 1)、基質(zhì)金屬蛋白酶- 9 (matrix metalloprotein- 9,MMP- 9) ELISA試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、鈣測試盒(南京建成生物工程研究所)；Von Kossa染液(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、模型組(model)、小檗堿組(BBR)和阿托伐他汀組(atorvastatain)，每組12只。高脂喂養(yǎng)4周，灌胃給予BBR 100 mg/(kg·d)治療4周，同時(shí)繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。

1.2.2 病理染色及免疫組化：固定后的主動(dòng)脈根部進(jìn)行脫水，石蠟包埋并切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤和血管內(nèi)壁斑塊情況；Von Kossa染色觀察血管鈣化情況；進(jìn)行BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2的免疫組化，觀察血管組織中4個(gè)指標(biāo)的表達(dá)情況。

1.2.3 動(dòng)物血液及組織中生化指標(biāo)的檢測：取心臟血，血液于 4 ℃、3 000 r/min 離心 25 min，收集血清。全自動(dòng)生化儀檢測血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平；ELISA試劑盒檢測IL- 6、BMP- 2的表達(dá)；主動(dòng)脈組織加入裂解液后進(jìn)行超聲勻漿后離心收集上清，化學(xué)發(fā)光法檢測血清和組織勻漿中的ALP和鈣含量。

1.2.4 細(xì)胞的分組及處理：收集對(duì)數(shù)增殖期的HUVECs細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h貼壁后，隨機(jī)分為6個(gè)組：對(duì)照組(control)；DMSO組(DMSO)，加入25 μg/L的TNF-α和0.1%的DMSO；BBR各處理組(7.5、10、15和20 mg/L)，分別加入25 μg/L的TNF-α和7.5、10、15和20 mg/L的BBR。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清，用ELISA試劑盒按說明書方法檢測上清中ICAM、VCAM和MMP- 9的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)高脂飲食小鼠的血脂調(diào)節(jié)作用

模型組小鼠8周后血脂TC、LDL-C含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.001)，BBR治療組和阿托伐他汀組較模型組明顯回降(P<0.05)(圖1)。

2.2 BBR對(duì)小鼠主動(dòng)脈形態(tài)變化和炎性浸潤的影響

與對(duì)照組(圖2A)相比，模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，血管內(nèi)壁有斑塊突起，甚至有的已經(jīng)脫落，炎性細(xì)胞浸潤明顯(圖2B)。BBR治療組和阿托伐他汀組AS病變均得到控制，未見斑塊突起，內(nèi)膜也較為平滑，炎性浸潤明顯減少，基本恢復(fù)正常水平(圖 2C，D)。

2.3 BBR對(duì)主動(dòng)脈組織中鈣鹽沉積的影響

模型組血管及斑塊中可見大量褐黑色顆粒沉積，表明有大量鈣鹽沉積、典型血管鈣化形成。給予BBR治療的小鼠鈣鹽沉積明顯減少，陽性藥組效果不明顯(圖3)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with model group; ***P<0.001 compared with control group

A.control; B.model; C.BBR; D.atorvastatain圖2 HE染色觀察各組小鼠主動(dòng)脈形態(tài)變化和炎性細(xì)胞浸潤程度Fig 2 Recruitment of infiltrated inflammatory cell and morphology in aorta tissue stained with HE

2.4 BBR對(duì)主動(dòng)脈組織中BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2的表達(dá)量的影響

模型組小鼠主動(dòng)脈AS斑塊形成明顯，BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2表達(dá)量明顯增多(圖4)，尤其集中在斑塊部位。BBR治療組小鼠主動(dòng)脈未見AS斑塊形成，4個(gè)指標(biāo)的表達(dá)量也比較少。

A.control; B.model; C.BBR; D.atorvastatain圖3 Von Kossa染色觀察各組小鼠主動(dòng)脈鈣鹽沉積情況Fig 3 Calcium deposition in aorta tissues stained with Von Kossa

圖4 小鼠主動(dòng)脈組織中BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2表達(dá)情況比較Fig 4 Comparison of BMP- 2，OPG，OCN and RUNX2 expression in mice aorta tissues(×400，n=5)

2.5 BBR對(duì)小鼠血清及血管組織中IL- 6、TNF-α、ALP、BMP- 2和鈣含量的影響

模型組小鼠血清中IL- 6和主動(dòng)脈血管組織中TNF-α表達(dá)明顯升高(P<0.05)，BBR治療組和阿托伐他汀組則明顯回降(P<0.05)。模型組小鼠血清和組織勻漿中的ALP、 BMP- 2和鈣含量明顯增加(P<0.05)，BBR治療組小鼠血清和組織勻漿中ALP、 BMP- 2和鈣含量明顯回降(P<0.05)(圖 5)。

2.6 BBR對(duì)HUVECs細(xì)胞ICAM、VCAM和MMP- 9分泌的影響

對(duì)照組的HUVECs細(xì)胞上清液中ICAM和VCAM的水平較低，給予25 μg/L的TNF-α刺激后，HUVECs分泌ICAM和VCAM水平顯著增加(P<0.001)，而BBR對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的ICAM和VCAM分泌有明顯抑制作用，且對(duì)于VCAM的抑制作用有濃度依賴性，15 mg/L的BBR可以抑制TNF-α引起的ICAM的分泌(P<0.05)(圖6)，7.5、10和15 mg/L的BBR可以抑制TNF-α引起的VCAM的分泌(P<0.01)(圖6)。與對(duì)照組相比，模型組HUVECs細(xì)胞上清中的MMP- 9水平顯著增加，而BBR對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MMP- 9的分泌有明顯抑制作用，7.5、10和20 mg/L能下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MMP- 9的分泌(P<0.05)(圖6)。

#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with model group

#P<0.05，##P<0.001 compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with DMSO group

3 討論

AS的發(fā)生會(huì)引起血管形態(tài)的改變，主動(dòng)脈斷面HE染色結(jié)果顯示BBR可有效抑制血管內(nèi)壁斑塊的形成和炎性細(xì)胞浸潤，通過抗炎作用緩解動(dòng)脈粥樣硬化的形成。本研究證實(shí)，高脂飲食的Apo-/-E小鼠體內(nèi)IL- 6和TNF-α水平明顯增高，給予BBR治療后，這兩種細(xì)胞因子水平明顯下調(diào)。TNF-α和IL- 6均可誘導(dǎo)核因子NF-κB的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM- 1、 ICAM- 1的產(chǎn)生[3- 4]。因此，BBR可能通過抑制炎性介質(zhì)的釋放在血管內(nèi)皮局部發(fā)揮抗感染作用。

AS的發(fā)病過程中涉及血管內(nèi)皮的損傷，伴有VCAM- 1、 ICAM- 1和MMP- 9的表達(dá)上調(diào)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過TNF-α刺激，可誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生炎性反應(yīng)，模擬血管內(nèi)皮的損傷，促進(jìn)VCAM- 1、 ICAM- 1和MMP- 9的表達(dá)量明顯上調(diào)，而BBR可以抑制上述蛋白表達(dá)的上調(diào)，提示BBR可能通過抑制VCAM- 1、ICAM- 1和MMP- 9的分泌來發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用。

血管鈣化是導(dǎo)致主要心血管事件的重要危險(xiǎn)因子，血管鈣化伴有BMP- 2等促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的因子的表達(dá)上調(diào)[6]，并引發(fā)下游通路中Runx2、OPG和OCN的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)鈣化的發(fā)展[7- 8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，炎性反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病中血管鈣化的催化因素，炎性因子例如TNF-α的釋放上調(diào)BMP- 2的表達(dá)，促進(jìn)了血管鈣化[9]。本研究結(jié)果表明，在高脂飲食小鼠的血漿和組織中，ALP、BMP- 2、OPG、OCN、RUNX2和鈣的水平都明顯增高，斑塊處尤其明顯，給予BBR治療后明顯下調(diào)，接近正常水平。阿托伐他汀對(duì)血管鈣化相關(guān)指標(biāo)的影響并不明顯，證明BBR具有緩解血管鈣化的作用，提示BBR可能是通過抑制了ALP和BMP- 2通路中的BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2因子緩解了血管鈣化，從而間接發(fā)揮了緩解AS的作用。

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