轉(zhuǎn)染攜帶Ifi204基因的慢病毒上調(diào)大鼠主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞的p204表達(dá)

胡 慧，吳 強(qiáng)，田茂波

(1.貴州省六盤(pán)水市人民醫(yī)院 老年病科， 貴州 六盤(pán)水 553001； 2.貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

血管外膜成纖維細(xì)胞(vascular adventitial fibroblast,VAF)的激活、增殖、分泌細(xì)胞因子及合成細(xì)胞外基質(zhì)異常是血管疾病的重要機(jī)制之一[1- 2]。干擾素(interferon,IFN)及其誘導(dǎo)表達(dá)的系列干擾素誘導(dǎo)蛋白(interferon-inducible protein，IFI)具有調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的作用。IFIp204是p200家族中6個(gè)鼠類(lèi)同源蛋白的成員之一，由Ifi204基因編碼。α-干擾素可通過(guò)誘導(dǎo)p204表達(dá)抑制大鼠主動(dòng)脈VAF增殖[3- 4]。本研究用攜帶Ifi204的慢病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈VAF，觀察轉(zhuǎn)染效率和p204的表達(dá)，為p204表達(dá)變化對(duì)大鼠VAF生物學(xué)功能的影響及其在血管疾病中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)SD大鼠約4周齡，體質(zhì)量110～130 g，雌雄不限[貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK (黔)2012- 001]。細(xì)胞培養(yǎng)及純化用的胎牛血清(Santa Cruz公司); DMEM高糖培養(yǎng)液、蘇木精、二甲苯(Hyclone公司)；Pv- 9000二步法免疫組化驗(yàn)查試劑盒(北京中杉金橋公司)；含Ifi204的慢病毒顆粒(廣州復(fù)能基因有限公司構(gòu)建)；總RNA 提取試劑盒(Life公司)；q-PCR 2步法試劑盒(北京天根公司)。DRR420A 試劑盒(TaKaRa公司)。PCR引物(上海生工公司合成)；P204一抗(GeneTex公司)；通用二抗(Abmart公司)。GAPDH抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VAF的培養(yǎng)、純化及鑒定：按文獻(xiàn)[5]介紹的植塊貼壁法培養(yǎng)大鼠原代VAF。觀察細(xì)胞增殖至80%匯合度時(shí)進(jìn)行首次傳代，應(yīng)用差速貼壁法純化VAF。用2 ～ 4 代細(xì)胞懸液制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%～80%時(shí)，用多聚甲醛固定，PBS漂洗，PV- 9000染色，DABI工作液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核15～30 s。配制梯度乙醇，乙醇濃度(%)依次為50、75、90和100，細(xì)胞分別放置時(shí)間為5、5、5和10 min脫水。二甲苯中透明細(xì)胞5 min，最后在倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分3組：攜帶Ifi204基因的慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠VAF作為Ifi204組，空載慢病毒處理的VAF作為對(duì)照組(C組)，未處理的VAF作為空白組(N組)。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染：用逐孔稀釋法測(cè)定、復(fù)核慢病毒滴度。設(shè)置MOI=0、10、20、40、60、80和100共7組，根據(jù)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)，準(zhǔn)確計(jì)算慢病毒量，使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液，盡可能保證所獲得的含有慢病毒或攜帶Ifi204的慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。按5×104個(gè)/孔接種對(duì)數(shù)增殖期的VAF于兩個(gè)6孔培養(yǎng)板，鋪板時(shí)細(xì)胞匯合度約為50%，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度約為70%。吸取含慢病毒及攜帶Ifi204慢病毒的DMEM，分別加入上述6孔培養(yǎng)板，放入5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，分別于24、48和72 h觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)及轉(zhuǎn)染情況，如細(xì)胞增殖狀態(tài)良好，可于72 h加入嘌呤霉素繼續(xù)孵育，于第5天在倒置相差熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)，檢查感染效率，篩選細(xì)胞拍照并選取最佳MOI值。

1.2.4 q-PCR法檢測(cè)p204的 mRNA表達(dá)：按Trizol總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，用核酸蛋白分析儀測(cè)定總RNA純度和濃度。取1 μg的RNA按q-PCR兩步法試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取A260/A280比值為1.8～2.0的RNA進(jìn)行q-PCR。按DRR420A試劑盒說(shuō)明書(shū)操作擴(kuò)增PCR。反應(yīng)條件：預(yù)變性90 ℃ 40 s，變性95 ℃ 5 s，退火、延伸50 ℃ 30 s，共經(jīng)40個(gè)循環(huán)。PCR引物序列(表1)。按2-ΔΔCt法計(jì)算3組p204 mRNA的豐度。

表1 p204和內(nèi)參引物序列Table 1 Sequence of primers and p204

1.2.5 Western blot檢測(cè)p204蛋白表達(dá):提取各組細(xì)胞的總蛋白。用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行蛋白定量。制膠、電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后封閉，一抗、二抗孵育，將與分離膠大小相當(dāng)?shù)腘C膜在暗室中進(jìn)行曝光、顯影、定影，以膠片透明為止，掃描膠片結(jié)果，用WCJF Image J軟件分析各條帶灰度與管家蛋白tubulin灰度的比值，據(jù)比值分析3組p204蛋白表達(dá)的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的VAF形態(tài)及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

VAF貼壁后呈菱形或長(zhǎng)梭形多層排列，部分交織成網(wǎng)狀，高低起伏，細(xì)胞立體感和折光性強(qiáng)(圖1A)。經(jīng)vimentin蛋白免疫印跡，陽(yáng)性細(xì)胞輪廓清楚，胞質(zhì)著棕黃色，核清晰可見(jiàn)，背景清晰無(wú)特異性著色，陽(yáng)性率達(dá)90%以上(圖1B)。

2.2 攜帶Ifi204基因的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細(xì)胞后熒光質(zhì)控轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI=80時(shí)，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，細(xì)胞狀態(tài)較好。轉(zhuǎn)染后48和72 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率分別為70%和80%。于第5天在熒光顯微鏡下觀察仍可見(jiàn)75%左右的大鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光(圖2)。

2.3 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204的 mRNA表達(dá)

與N 組及C組比較，Ifi204組的p204 mRNA表達(dá)增加(P<0. 01)(圖3)。

2.4 干擾素誘導(dǎo)蛋白p204蛋白水平的變化

干擾素誘導(dǎo)蛋白p204在Ifi204組、N組和C組均存在一定豐度的結(jié)構(gòu)表達(dá)，與N 組及C組比較，Ifi204組的p204 蛋白表達(dá)增加(P<0. 01)(圖4)。

A.light microscopy features of VAFs(× 200); B.VAFs was identified by immunocytochemistry(×100)圖1 采用植塊貼壁法培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈VAF的光鏡特征和鑒定

圖2 慢病毒介導(dǎo)Ifi204基因轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細(xì)胞熒光質(zhì)控轉(zhuǎn)染效率Fig 2 Translatlion efficient of Ifi204 gene was mediated by lentivirus(×100)

*P<0.01 compared with C and N group圖3 p204 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 3 Expression of p204 mRNA

*P<0.01 compared with C and N group圖4 p204 蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 4 Expression of p204 protein(±s, n=4)

3 討論

IFN與細(xì)胞膜受體結(jié)合后觸發(fā)JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路[6]，在干擾素調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用下，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列IFI，從而發(fā)揮其眾多生物學(xué)效應(yīng)。干擾素誘導(dǎo)蛋白p200家族[7]是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)IFI，其成員IFI16具有抑制人腦血管成纖維細(xì)胞增殖、遷移及新生血管形成的作用[8]，參與對(duì)血管內(nèi)皮炎性因子的誘導(dǎo)。血管修復(fù)和內(nèi)膜增生的過(guò)程在不同物種(小鼠、豬和人)和不同動(dòng)脈(肱動(dòng)脈、髂動(dòng)脈、股動(dòng)脈及主動(dòng)脈)是類(lèi)似的[9]。p200家族真正意義上的鼠/人之間(跨物種)的同源基因尚未發(fā)現(xiàn)[10]。p204可看作為“人的IFI 16”，因?yàn)樗鼈兌己蠵AAD/DAPIN/Pyrin結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列相似度為51%)和一對(duì)200 X序列(相似度為51.3%)。提示促進(jìn)p204的表達(dá)可能也參與調(diào)控血管壁各種細(xì)胞的增殖、遷移及新生血管的形成。其機(jī)制與p204延緩細(xì)胞G0/G1期進(jìn)入S期[11 ]、抑制細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換[12]、抑制rRNA的合成有關(guān)。p204的誘導(dǎo)表達(dá)還是工作心肌細(xì)胞、骨骼肌肌管、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等多種組織及細(xì)胞分化的關(guān)鍵步驟。但在不同品系的大鼠中，IFNs對(duì)p204的誘導(dǎo)效率并不相同，提示p204表達(dá)不受內(nèi)源性IFN的影響[13]。

病毒介導(dǎo)是生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方式之一，本研究探索出一套慢病毒載體介導(dǎo)Ifi204基因轉(zhuǎn)染VAF的技術(shù)，其轉(zhuǎn)染效率高和表達(dá)持久。證實(shí)了通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶Ifi204基因的慢病毒可誘導(dǎo)p204在鼠血管VAF 過(guò)表達(dá)，為進(jìn)一步探討Ifi204基因過(guò)表達(dá)后對(duì)VAF增殖、凋亡與遷移的影響及分子機(jī)制的研究作鋪墊，為p204通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染方式應(yīng)用于血管增殖疾病的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有廣闊應(yīng)用前景。

[1] Strauss BH, Rabinovitch M. Adventitial fibroblasts: defining a role in vessel wall remodeling[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, 22:1- 3.

[2] Chiang HY, Korshunov VA, Serour A,etal. Fibronectin is an important regulator of flow-induced vascular remodeling[J]. Arterioscler Thromb Vasc Bio,2009, 29:1074- 1079.

[3] 宋方,吳強(qiáng),譚洪文,等.IFIα通過(guò)p204抑制大鼠主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞增殖[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2012,32:1431- 1436.

[4] Asefa B, Klarmann KD, Copeland NG,etal. The interferon-inducible p200 family of proteins: a perspective on their roles in cell cycle regulation and differentiation[J]. Blood Cells Mol Dis, 2004, 32: 155- 167.

[5] 宋方,吳強(qiáng),陸德琴,等.一套系統(tǒng)培養(yǎng)鼠主動(dòng)脈血管壁細(xì)胞簡(jiǎn)單可靠的方法[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2011,19: 361- 366.

[6] Gough DJ, Levy DE, Johnstone RW,etal. IFN gamma signaling-does it mean JAK-STAT? [J].Cytokine Growth Factor Rev, 2008, 19: 383- 394.

[7] Luan Y, Lengyel P, Liu CJ. p204, a p200 family protein, as a multifunctional regulator of cell proliferation and differentiation[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2008, 19: 357- 369.

[8] Raffaella R, Gioia D, De Andrea M,etal. The inter-feron-inducible IFI16 gene inhibits tube morphogenesis and proliferation of primary, but not HPV16 E6/E7-immortalized human endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 2004, 293: 331- 345.

[9] Harvat BL,Jetten AM. Gamma-interferon induces an irreversible growth arrest inmid.G1 in mammary epithelial cells which correlates with a block in hyperphosphorylation of retinoblastoma[J]. Cell Growth,1996, 7:289- 300.

[10] Garcia-Sastre A, Biron CA.Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente[J]. Science, 2006,312:879- 882.

[11] 韓清見(jiàn),張耀洲.心臟干/祖細(xì)胞研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2008,30: 317- 322.

[12] Asefa B, Dermott JM, Kaldis P,etal. p205, a potential tumor suppressor, inhibits cell proliferation via multiple pathways of cell cycle regulation[J]. FEBS Lett, 2006,580: 1205- 1214.

[13] Seelig HP, Ehrfeld H, Renz M. Interferon-gamma-inducible protein p16. A new target of antinuclear antibodies in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum, 1994,37: 1672- 1683.