GNA11基因多態(tài)性與特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥及其并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)

全婷婷，聶 敏，王亞冰，姜 艷，李 梅，夏維波，王 鷗，邢小平

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會內(nèi)分泌重點實驗室， 北京 100730)

特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥(idiopathic hypoparathyroidism，IHP)是一種以低鈣血癥、高磷血癥時甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)降低或在不適當(dāng)正常范圍內(nèi)為主要生化改變的罕見疾病，其病因或發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。臨床上患者除有低鈣血癥相關(guān)表現(xiàn)如感覺異常、手足搐搦等外，部分還可出現(xiàn)顱內(nèi)鈣化、白內(nèi)障、治療相關(guān)性高鈣尿癥、泌尿系鈣質(zhì)沉著或結(jié)石等慢性并發(fā)癥。目前有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)部分甲旁減相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能與IHP發(fā)病機(jī)制、臨床特點及病情程度有關(guān)[1- 2]。

近年來新發(fā)現(xiàn)GNA11基因激活性突變導(dǎo)致編碼的G蛋白α亞基11(G-protein subunit-α 11，Gα11)功能活躍，此蛋白為鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)下游信號通路的重要蛋白伴侶，最終引起一種臨床表現(xiàn)類似常染色體顯性遺傳低鈣血癥(autosomal dominant hypocalcemia，ADH)的疾病，被命名為2型ADH[3- 5]。為探索GNA11基因多態(tài)性與IHP疾病及其慢性并發(fā)癥發(fā)生的相關(guān)性，本研究首次比較了GNA11基因標(biāo)簽SNP(TaqSNPs)的各基因型及單體型在IHP患者與正常對照間的分布特點，并探索了上述基因型及單體型與其臨床表型多樣性的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

病例組來自1987年12月至2015年12月于北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診的成年起病甲旁減患者共203例(男性81例，女性122例)，并排除有以下病史者：1)甲旁減家族史；2)合并Addison病、1型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、念珠菌感染等免疫性疾病；3)合并先天性心臟病、顏面畸形、腎臟異常、聽力下降等先天發(fā)育異常；4)頸部手術(shù)或放療史。同時納入來自北京協(xié)和醫(yī)院健康體檢中心的年齡及性別匹配的健康人群共209名(男性103名，女性106名)作為對照組，排除肝腎功能不全、消化不良或胃腸手術(shù)史、惡性腫瘤、自身免疫性疾病及有影響鈣磷代謝的藥物使用史者。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集：記錄所有研究對象的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)以及病例組的起病年齡、病程，通過頭顱CT平掃、眼科裂隙燈和泌尿系超聲檢查記錄IHP患者顱內(nèi)鈣化、低鈣性白內(nèi)障、泌尿系統(tǒng)鈣質(zhì)沉著或結(jié)石的發(fā)生情況。

1.2.2 實驗室檢查：血清總鈣、磷、堿性磷酸酶和肌酐：分別采用偶氮砷Ⅲ法、磷鉬酸法和酶法，由全自動生化分析儀測定。24 h尿鈣：與血清總鈣測定方法相同。血清PTH：1984年4月至1992年9月采用放射免疫法測定氨基端PTH[正常值(21.4±7.7) ng/L]；1992年10月至1998年7月采用放射免疫法測定中間段PTH(正常值60～450 ng/L)；1998年以后采用化學(xué)發(fā)光法測定全段PTH，正常值為(12～65) pg/mL。有8例患者于1998年7月前就診，但因PTH測定方法不同，未納入PTH水平的統(tǒng)計描述中。

1.2.3 SNP的挑選及分型

1.2.3.1 標(biāo)簽SNP(TaqSNP)挑選：在NCBI附屬網(wǎng)站http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html中進(jìn)行查找：1)在中國漢族人群的GNA11基因序列中選?。?)最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05；(3)r2>0.8。最終選取了10個SNP，自5′至3′方向，依次為rs308039、rs1104737、rs17828831、rs308033、rs2238625、rs308060、rs385443、rs3786947、rs3746069和rs308049。

1.2.3.2 SNP的分型：采用OMEGA Blood DNA Midi Kit試劑盒提取所有研究對象的基因組DNA，由博淼生物科技(北京)有限公司通過Sequenom MassArray iPLEX分型平臺進(jìn)行SNP分型[6]，同時隨機(jī)選取10%樣本，應(yīng)用Sanger測序分別驗證上述位點的分型結(jié)果，提示兩種分型方法一致性為100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

計數(shù)資料以樣本量(百分率)表示，采用卡方檢驗、Fisher精確檢驗進(jìn)行比較。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)M(P25，P75)表示，采用成組t檢驗或非參數(shù)檢驗進(jìn)行比較。采用卡方檢驗各SNP位點基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用Haploview 4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡結(jié)構(gòu)域及單倍體的推斷，以phase 2.0軟件對每例個體進(jìn)行單倍體分型。將各基因型分別在加性模型(A1A1vsA1A2vsA2A2，A1指常見等位基因，A2指少見等位基因)中以0、1、2賦值，顯性(A1A1vsA1A2+A2A2)及隱性模型(A1A1 +A1A2vsA2A2)以0、1賦值后，對各病例、對照組進(jìn)行二分類邏輯回歸分析。單體型分析方法結(jié)果同上，其中0代表攜帶0條該單體型，1代表攜帶1條該單體型，2代表攜帶2條該單體型。在給予鈣劑與維生素D制劑治療后IHP患者中，以尿鈣水平為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析(經(jīng)年齡、性別、治療后血鈣及血磷水平校正，上述自變量經(jīng)單變量分析明確與尿鈣排泄相關(guān))。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料及實驗室檢查

IHP患者起病年齡四分位數(shù)間距為24～38歲，首次就診時均有顯著的低鈣血癥(1.63±0.31)mmol/L、高磷血癥(1.90±0.39)mmol/L，且同步PTH水平為3.0 (3.0, 56.6)pg/mL。與之相比，正常對照組除血鈣、血磷及堿性磷酸酶水平外，性別、年齡、BMI未見統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(表1)。

2.2 GNA11基因各位點基本信息、分型及單倍體分型結(jié)果

篩選所得的10個SNP位點，分型成功率均大于98%。除rs2238625外，余位點在病例組及對照組中的等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)(表2)，遂在后續(xù)分析中剔除rs2238625。以Haploview進(jìn)行單倍體分型，各位點自5′至3′排列，結(jié)果提示rs308033、rs308060、rs385443、rs3786947、rs3746069和rs308049存在高度的連鎖不平衡(D′> 90)，以此建立單倍體，共獲得9種可能單體型，其中5種常見單體型(單體型頻率>0.1)可以解釋全部個體中92.5%的單體型分布(圖1)。

2.3 GNA11各位點基因型、單體型與IHP發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性

rs308060的基因型在加性模型[TCvsCC，OR=2.505(1.005～6.245)，P<0.05；TTvsCC，OR=3.269(1.264～8.458)，P<0.05]、隱性模型[TTvsCC+ TC，OR=2.727(1.105～6.727)，P<0.05]中可增加IHP發(fā)病風(fēng)險。同樣，單體型2(即TTCGCC)在加性模型[OR=2.726(1.036～7.178)，P<0.05；OR=3.321(1.215～9.076)，P<0.05]、隱性模型[OR=2.895(1.109～7.553)，P<0.05]中均與IHP發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，此單體型為IHP的致病因素，且致病性隨著攜帶單體型數(shù)目的增加而增加(表3)。

表1 病例、對照組的人口學(xué)特點及生化指標(biāo)Table 1 Anthropometric and clinical characteristics of the cases and controls

aChi-square test;bStudent’s test;cMann-Whitney U test；*8 patients, who were diagnosed with hypoparathyroidism before July 1998, were excluded in the statistical description because of the different testing methods of PTH level.

表2 GNA11基因各TaqSNP的基本信息Table 2 TaqSNPs information of GNA11 gene

SNP.single nucleotide polymorphisms; HWE.hardy-weinberg equilibrium.

A.LD blocks and correlation coefficients among GNA11 SNPs in haploview; B.haplotype frequencies of GNA11 polymorphisms圖1 GNA11基因SNP組成各單體型的分析Fig 1 Analysis of the haplotypes consisted of different SNPs in GNA11 gene

2.4 SNP位點基因型及單體型與IHP慢性并發(fā)癥的關(guān)系

2.4.1 各位點基因型間、常見單體型數(shù)目組間顱內(nèi)鈣化及白內(nèi)障發(fā)生率的比較：共146例進(jìn)行頭顱CT平掃檢查，發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)鈣化者91例(62.3%)；68例進(jìn)行了眼科裂隙燈檢查，發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障者51例(75.0%)。根據(jù)是否攜帶各位點的少見基因或某種單倍體型，將上述患者分為兩組(攜帶與未攜帶者)，進(jìn)行各位點、單體型顱內(nèi)鈣化及白內(nèi)障發(fā)生率的比較，未觀察到有顯著性差異(表4)。

表3 GNA11基因SNP的基因型、單體型與特發(fā)性甲旁減發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性分析(病例-對照研究)Table 3 The association of GNA11 genotypes and haplotypes with IHP risk in case-control groups

Haplotype 1～5 for haplotype CCGGTC,TTCGCC,CCCGCC,CCCACC and CCGGCT, respectively; genotypes and haplotypes were assigned codes of 0, 1 and 2 in the additive model, 0, 1 and 1 in the dominant model, and 0, 0 and 1 in the recessive model, according to the number of minor allele or copies of haplotype;*subjects without minor alleles or copies of haplotype are the reference.

表4 攜帶與未攜帶少見基因或單體型的特發(fā)甲旁減患者顱內(nèi)鈣化及白內(nèi)障發(fā)生率的比較

續(xù)表4

SNPIDmodelaintracranialcalcification,N(%)POR(95%CI)cataract,N(%)POR(95%CI)rs308033052/85(61.2)0.7341.125(0.570,2.222)31/40(77.5)0.5690.726(0.240,2.193)139/61(63.9)20/28(71.4)rs308060054/89(60.7)0.5231.260(0.620,2.563)29/38(76.3)0.7000.798(0.253,2.519)135/53(66.0)18/25(72.0)rs385443030/48(62.5)0.9400.973(0.477,1.986)18/23(78.3)0.6210.741(0.225,2.441)160/107(61.9)32/44(72.7)rs3786947062/104(59.6)0.2491.581(0.723,3.453)33/46(71.7)0.4211.674(0.473,5.927)128/40(70.0)17/21(81.0)rs3746069050/82(61.0)0.7031.141(0.580,2.244)28/38(73.7)0.7781.173(0.386,3.569)141/64(64.1)23/30(76.7)rs308049065/105(61.9)0.6711.183(0.544,2.575)38/50(76.0)0.5640.695(0.201,2.402)125/38(65.8)11/16(68.8)Haplotype1050/82(61.0)0.7031.141(0.580,2.244)27/37(73.0)0.6731.270(0.418,3.859)141/64(64.1)24/31(77.4)Haplotype2056/93(60.2)0.4851.285(0.635,2.597)33/43(76.7)0.6630.779(0.253,2.397)135/43(66.0)18/25(72.0)Haplotype3061/94(64.9)0.3900.738(0.368,1.477)33/43(76.7)0.6630.779(0.253,2.397)130/52(57.7)18/25(72.0)Haplotype4063/105(60.0)0.3531.436(0.668,3.086)34/47(72.3)0.4491.625(0.460,5.745)128/41(68.3)17/21(81.0)Haplotype5066/107(61.7)0.7891.109(0.518,2.376)40/52(76.9)0.5090.660(0.191,2.277)125/39(64.1)11/16(68.8)

a0: patients without minor alleles or haplotypes; 1.patients with one or more minor alleles or haplotype;bnumber of patients who received cranial CT scan;cnumber of patients who received slit lamp examination.

2.4.2 IHP患者治療后尿鈣水平在各位點基因型間、常見單體型數(shù)目組間的比較：所有IHP患者在給予鈣劑及維生素D制劑(如普通維生素D、活性維生素D)治療后，血鈣、血磷水平較前改善的同時，每日尿鈣排泄水平隨之升高，部分患者出現(xiàn)高鈣尿癥。為探索GNA11各位點是否與患者治療尿鈣水平相關(guān)，在校正年齡、性別、血鈣及血磷后，多元線性回歸分析結(jié)果顯示IHP患者治療后24 h尿鈣排泄與單體型5(即CTCGCT)的顯性模型相關(guān)(β=0.186，P<0.05)，攜帶單體型CTCGCT的數(shù)目越多，尿鈣排泄水平越高(表5)。但在長期的隨診過程中，僅有4例患者出現(xiàn)泌尿系鈣質(zhì)沉著或結(jié)石，因此無法進(jìn)一步研究SNP位點的基因型及單體型是否與之發(fā)生有關(guān)。

3 討論

特發(fā)甲旁減的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，有關(guān)基因多態(tài)性與其發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)研究接受鈣劑亦較為有限。GNA11基因的胚系激活性突突變可引起Gα11功能異常，使鈣敏感受體信號通路持續(xù)激活，細(xì)胞外液鈣離子濃度-甲狀旁腺激素濃度的反應(yīng)曲線左移，抑制PTH的合成及分泌，影響鈣穩(wěn)態(tài)的維持，從而導(dǎo)致2型常染色體顯性遺傳低鈣血癥，成為遺傳性甲旁減的主要病因之一[4, 7- 9]。本研究觀察到，GNA11基因rs308060的少見等位基因T可能會增加IHP的發(fā)病風(fēng)險，同時包括其在內(nèi)的單體型TTCGCC亦與IHP發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，攜帶此單體型數(shù)目越多，發(fā)病風(fēng)險越高。因此提示基因多態(tài)性可能與特發(fā)甲旁減的易感性有關(guān)，為特發(fā)甲旁減發(fā)病機(jī)制的研究提供了一個新的方向。

表5 GNA11基因SNP基因型、單體型與IHP患者及維生素D制劑治療后尿鈣排泄的關(guān)系

Linear regression analysis of three models(additive, dominant and recessive), adjusted for age, gender, serum calcium and phospharus level.

IHP患者的顱內(nèi)鈣化、白內(nèi)障、高鈣尿癥及泌尿系鈣質(zhì)沉著/結(jié)石等慢性并發(fā)癥的發(fā)生率因人而異，具體原因尚不清楚。以顱內(nèi)鈣化為例，有報道顱內(nèi)鈣化的發(fā)生與鈣磷乘積有關(guān)[10]。此外，基底節(jié)表達(dá)的PTH1受體、PTH2受體、碳酸酐酶II、PTH依賴性鈉-磷轉(zhuǎn)運體等分子亦可能與顱內(nèi)鈣化有關(guān)[11- 14]。國外研究分析過PTH基因多態(tài)性與顱內(nèi)鈣化發(fā)生的關(guān)系，但并未發(fā)現(xiàn)有陽性結(jié)果[2]。因此，本研究探索了上述慢性并發(fā)癥發(fā)生率的差異與GNA11基因多態(tài)性的關(guān)系，但結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)兩者具有相關(guān)性。

2型常染色體顯性遺傳低鈣血癥患者遠(yuǎn)端腎小管對尿鈣的重吸收作用減弱，因此在給予鈣劑及維生素D制劑治療后容易出現(xiàn)高鈣尿癥[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，由rs308060少見基因T組成的單體型CTCGCT與尿鈣排泄水平相關(guān)，攜帶此單體型的數(shù)目越多，24 h尿鈣水平越高，進(jìn)而表明不僅是GNA11基因發(fā)生激活性突變會導(dǎo)致治療相關(guān)性高鈣尿癥，其基因多態(tài)性亦可能會影響高鈣尿癥的風(fēng)險。攜帶這些基因多態(tài)性位點少見基因的患者需在隨診過程中密切監(jiān)測血鈣、血磷、24 h尿鈣磷、腎功能及泌尿系統(tǒng)影像學(xué)檢查，及時調(diào)整鈣劑及維生素D制劑的劑量以避免出現(xiàn)高鈣尿癥，從而減少泌尿系鈣質(zhì)沉著或結(jié)石、腎功能受損等腎臟并發(fā)癥的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次通過基因型、單體型的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)GNA11基因的rs308060位點少見基因T可能會增加特發(fā)甲旁減的發(fā)病風(fēng)險，并且與患者接受鈣劑及維生素D制劑治療后的尿鈣排泄水平呈正相關(guān)，為甲旁減患者治療目標(biāo)的制定及監(jiān)測提供了參考。

[1] Park SY, Eom YS, Choi B,etal. Genetic and clinical characteristics of korean patients with isolated hypoparathyroidism: from the Korean hypopara registry study[J]. J Korean Med Sci, 2013,28:1489- 1495.

[2] Goswami R, Mohapatra T, Gupta N,etal. Parathyroid hormone gene polymorphism and sporadic idiopathic hypoparathyroidism[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004,89:4840- 4845.

[3] Mannstadt M, Harris M, Bravenboer B,etal. Germline mutations affecting Gα11 in hypoparathyroidism[J]. N Engl J Med, 2013,368:2531- 2532.

[4] Li D, Opas EE, Tuluc F,etal. Autosomal dominant hypoparathyroidism caused by germline mutation in GNA11: phenotypic and molecular characterization[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2014,99: E1774-E1783.

[5] Tenhola S, Voutilainen R, Reyes M,etal. Impaired growth and intracranial calcifications in autosomal dominant hypocalcemia caused by a GNA11 mutation[J]. Eur J Endocrinol, 2016,175:211- 218.

[6] Gabriel S, Ziaugra L, Tabbaa D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform[J]. Curr Protoc Hum Genet, 2009, Chapter 2:2- 12.

[7] Roszko KL, Bi RD, Mannstadt M. Autosomal dominant hypocalcemia (hypoparathyroidism) types 1 and 2[J]. Front Physiol, 2016,7:458.doi:10.3389/fphys.2016.00458.

[8] Hannan FM, Babinsky VN, Thakker RV. Disorders of the calcium-sensing receptor and partner proteins: insights into the molecular basis of calcium homeostasis[J]. J Mol Endocrinol, 2016,57: R127-R142.

[9] Nesbit MA, Hannan FM, Howles SA,etal. Mutations affecting G-protein subunit alpha11 in hypercalcemia and hypocalcemia[J]. N Engl J Med, 2013,368:2476- 2486.

[10] Goswami R, Sharma R, Sreenivas V,etal. Prevalence and progression of basal ganglia calcification and its pathogenic mechanism in patients with idiopathic hypoparathyroidism[J]. Clin Endocrinol, 2012,77:200- 206.

[11] Usdin TB, Bonner TI, Hoare SR. The parathyroid hormone 2 (PTH2) receptor[J]. Receptors Channels, 2002,8:211- 218.

[12] Kida E, Palminiello S, Golabek AA,etal. Carbonic anhydrase Ⅱ in the developing and adult human brain[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2006,65:664- 674.

[13] Fernandes I, Beliveau R, Friedlander G,etal. NaPO (4) cotransport type Ⅲ(PiT1) expression in human embryonic kidney cells and regulation by PTH[J]. Am J Physiol, 1999,277: F543-F551.

[14] Goswami R, Millo T, Mishra S,etal. Expression of osteogenic molecules in the caudate nucleus and gray matter and their potential relevance for Basal Ganglia calcification in hypoparathyroidism[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2014,99:1741- 1748.

[15] Shoback D. Clinical practice. Hypoparathyroidism[J]. N Engl J Med, 2008,359:391- 403.