高危型HPV DNA整合致宮頸癌的機(jī)制及檢測(cè)進(jìn)展

梁 銀，張守桃

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

宮頸癌指的是發(fā)生在宮頸部與子宮頸陰道的一種惡性腫瘤，屬常見婦科腫瘤，發(fā)生率僅次于乳腺癌。在近30年，宮頸癌發(fā)病率每年上升0.6%，全世界每年有20萬(wàn)人因?qū)m頸癌死亡，國(guó)內(nèi)每年將近5萬(wàn)人因?yàn)閷m頸癌而死。根據(jù)病理學(xué)描述性的診斷方法把宮頸癌前病變劃分成高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）與宮頸癌前病變分為低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL），也就是浸潤(rùn)性宮頸癌（ICC）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）與宮頸原位癌等。

1 HPV的整合位點(diǎn)

通常病毒整合的位置經(jīng)常會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生，傾向E1、E2、E4、E5區(qū)，上述區(qū)域區(qū)域被側(cè)翼宿主細(xì)胞中DNA所中斷。魏文斐[1]等人經(jīng)收集數(shù)個(gè)國(guó)內(nèi)外的研究，得出一共有400次整合的事件。梁潔瓊[2]等人于49個(gè)宮頸癌的樣本中找出117個(gè)獨(dú)立的整合位點(diǎn)，這些整合位點(diǎn)橫跨整個(gè)病毒的基因組。通常情況下，病毒整合發(fā)生在人類基因組內(nèi)含子以及編碼基因的密集區(qū)域，例如：轉(zhuǎn)錄活性區(qū)、致癌基因以及普通脆性位點(diǎn)。高危型HPV DNA一般整合至染色體之中，只有部分會(huì)整合至線粒體上，除了9、18、22號(hào)染色體以外，其他都有整合的位點(diǎn)。

2 HPV整合可能致癌機(jī)制

2.1 宿主的染色體異位與重排

病毒基因的整合會(huì)致使宿主染色體出現(xiàn)變化，主要包含非染色質(zhì)損害、染色體易位與缺失，一直到染色體發(fā)生重拍。高冬梅[3]等人研究中指出，將近33%整合位點(diǎn)出現(xiàn)基因的重排，HPV DNA病毒整合與基因組重排間有著高度的相關(guān)性。在宮頸癌的細(xì)胞系之中，HPV DNA整合在細(xì)胞核中的染色體上，會(huì)使得E6、E7的基因出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，引起中心體出現(xiàn)異常的擴(kuò)增，對(duì)細(xì)胞周期的有絲分裂保真度進(jìn)行破壞，導(dǎo)致非整倍體與染色體異常風(fēng)險(xiǎn)加大，屬于結(jié)構(gòu)染色體的不穩(wěn)定性與DNA破壞主要源頭。如果發(fā)生染色體易位，會(huì)使得基因發(fā)生斷裂，原癌的基因和其他基因會(huì)重新結(jié)合成融合基因，引起過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致抑癌基因的功能受到影響。

2.2 致癌基因的激活以及抑癌基因的失活

癌癥發(fā)展與發(fā)生是各類遺傳學(xué)功能與結(jié)構(gòu)改變后，出現(xiàn)致癌基因的激活以及抑癌基因的失活所致。pRb與p53抑癌基因能夠?qū)?xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，在E2F的轉(zhuǎn)錄因子作用下，可以激活pRb，對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。HPV16中E7與E6產(chǎn)物分別會(huì)和pRb、p53結(jié)合，然后生成相應(yīng)的復(fù)合體，從pRb-E2F的復(fù)合體中E2F會(huì)解離為游離態(tài)，降解p53以及pRb，導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控，致使細(xì)胞停滯在G1期進(jìn)入到無(wú)限的增殖。E6的癌蛋白也可以對(duì)c-myc的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，富含GC區(qū)SP1結(jié)合位點(diǎn)與cis元素myc基因過(guò)表達(dá)聯(lián)合誘導(dǎo)hTERT上調(diào)基因表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖能力與染色體穩(wěn)定性產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞永生化，所以端粒酶既是一個(gè)篩選癌癥的標(biāo)志物，又是癌癥治療的靶點(diǎn)。c-myc的基因主要處在染色體8q24.1的位置，經(jīng)過(guò)識(shí)別與結(jié)合靶序列之中CACGTG的核心序列，可以使得轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或是激活靶基因，經(jīng)順式作用可以將生長(zhǎng)抑制基因?qū)τ诩?xì)胞的無(wú)限增殖能力抑制解除，使得細(xì)胞永生化，并且會(huì)在HPV16/18中出現(xiàn)高度表達(dá)，能夠當(dāng)作宮頸癌的診斷以及預(yù)后治療評(píng)估指標(biāo)。

3 分析高危型HPV DNA整合狀態(tài)檢測(cè)的方法

3.1 分析DIPS-PCR的技術(shù)

連接介導(dǎo)（ligation-mediated）的PCR技術(shù)能夠?qū)φ先轭^瘤的病毒序列進(jìn)行檢測(cè)，用在HPV永生化角質(zhì)細(xì)胞系的基因組病毒于擴(kuò)增HPV相關(guān)宮頸癌細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)的連接體，與測(cè)序方法相結(jié)合，能夠?qū)θ旧w進(jìn)行檢測(cè)，能夠用作病毒早期的整合階段檢測(cè)方式。

3.2 分析MLPA的技術(shù)

多重連接依賴式探針擴(kuò)增（MLPA）是在PCR、雜交與連接基礎(chǔ)上，于單一反應(yīng)管內(nèi)對(duì)四十個(gè)不同核苷酸靶序列拷貝數(shù)變化進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，定位定量分析待測(cè)核苷酸的一種新技術(shù)。主要優(yōu)勢(shì)是操作比較簡(jiǎn)單、高通量、重復(fù)性好、靈敏度高于特異性高，在染色體的數(shù)目異常檢測(cè)中比較常用，可以用于甲基化、基因片段的缺失與重排中檢測(cè)。孫曉娟[4]等人通過(guò)MLPA技術(shù)對(duì)HPV16/18病毒載量與生理狀態(tài)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，研究結(jié)果得出MLPA的技術(shù)有著較高的敏感性。然而，因?yàn)槠鋽U(kuò)增為待測(cè)的探針，不屬于靶序列，因此不可以用在染色體的易位檢測(cè)與單個(gè)細(xì)胞的核苷酸檢測(cè)中。

3.3 分析APOT的方法

乳頭瘤病毒致癌基因的轉(zhuǎn)錄子擴(kuò)增法（APOT）方法，主要把mRNA的轉(zhuǎn)錄體當(dāng)作基礎(chǔ)，可以對(duì)游離體起源病毒轉(zhuǎn)錄體以及整合起源融合轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行識(shí)別，對(duì)RNA實(shí)施測(cè)序、逆轉(zhuǎn)錄以及PCR的擴(kuò)增，對(duì)HPV中游離轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行分析，以便對(duì)病毒生理的狀態(tài)進(jìn)行鑒定。APOT的技術(shù)既可以對(duì)病毒的生理狀態(tài)進(jìn)行鑒定，又可以對(duì)E6與E7的致癌基因病毒整合具體位點(diǎn)與表達(dá)水平進(jìn)行深入研究，相較于實(shí)時(shí)定量的PCR技術(shù)，其敏感度比較該，然而這種技術(shù)只可以對(duì)短RNA的轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞中需要具備游離的轉(zhuǎn)錄體才可以擴(kuò)增，其應(yīng)用范圍比較狹窄。

3.4 測(cè)序技術(shù)與雜交捕獲法

雜交捕獲方法（HC）主要是按照高危型DNA的全基因組文庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)捕獲的探針，在DNA文庫(kù)與捕獲探針雜交以后，通過(guò)鏈霉素親、生物素吸附素磁珠吸，沒有捕獲DNA被洗脫，并且洗脫DNA中如果存在整合位點(diǎn)，會(huì)繼續(xù)實(shí)施測(cè)序與PCR擴(kuò)增，獲得病毒整合的染色體圖譜。H屬于唯一獲得FDA批準(zhǔn)分型檢測(cè)HPV方法，能夠?qū)?3種的高危型HPV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合測(cè)序方法，可以檢測(cè)整合位點(diǎn)與分型，是現(xiàn)階段HPV檢測(cè)的一種較好方式。朱義保[5]等人應(yīng)用這種技術(shù)一共發(fā)現(xiàn)110多個(gè)整合位點(diǎn)，相較于DIPS-PCR的技術(shù)，其敏感度比較高。但是因?yàn)樵摷夹g(shù)花費(fèi)比較高，對(duì)于設(shè)備要求相對(duì)較高，導(dǎo)致基層普及的難度比較大。

4 結(jié) 論

總之，HPV疫苗包含醫(yī)療性與預(yù)防性的疫苗，其中預(yù)防性的疫苗把L1、L2當(dāng)作靶抗原，可以在細(xì)胞表面組裝為病毒樣顆粒（VLPs），類似于天然病毒的顆粒結(jié)構(gòu)，免疫原性比較高，可以引起棘突特異性局部免疫與抗體的反應(yīng)，避免機(jī)體受到HPV的感染。因此，在臨床上，經(jīng)過(guò)準(zhǔn)確篩查HPV，能夠給臨床治療與預(yù)后提供保障。

[1] 魏文斐,蘇桂棟,吳蘭芳.宮頸癌與癌前病變組織中HPV-16的整合感染狀態(tài)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,23(1):47-50.

[2] 梁潔瓊,趙 敏.高危型人乳頭瘤病毒整合態(tài)與宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌關(guān)系的探討[J].中國(guó)藥物與臨床,2014,14(4):431-433.

[3] 高冬梅,龍 梅,張 璐.新疆維吾爾族宮頸癌組織中 HPV-DNA 表達(dá)及存在狀態(tài)的研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,11(7):837-840.

[4] 孫曉娟,王 健.人乳頭瘤病毒16的整合作用在不同宮頸病變組織中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)綜合臨床,2017,33(1):18-21.

[5] 朱義保,謝 彤,楊亮亮.人乳頭瘤病毒HPV16整合與宮頸病變程度的研究[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2015,21(4):395-398.