MALDI-MS在各領(lǐng)域的應(yīng)用概述

秦園，陳祝軍

（張家港市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 張家港 215600）

質(zhì)譜分析是將待測(cè)物質(zhì)電離化，并通過(guò)質(zhì)荷比來(lái)檢測(cè)和鑒定不同物質(zhì)的一種技術(shù)。在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，質(zhì)譜分析的運(yùn)用只停留在化學(xué)研究領(lǐng)域，并通常和一些預(yù)分離技術(shù)串聯(lián)使用，如液相質(zhì)譜和氣相質(zhì)譜等，但液相質(zhì)譜和氣相質(zhì)譜無(wú)法對(duì)生物分子進(jìn)行空間定位分析。

1988年Karas和Hillenkamp第一次報(bào)道了基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(Matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry, MALDI-MS)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，他們通過(guò)MALDI-MS技術(shù)成功地將血清白蛋白從煙堿酸基質(zhì)中電離出來(lái)，這次突破性的研究為分析科學(xué)領(lǐng)域開(kāi)辟了新的前景。隨著電子噴霧離子化(Electron spray ionization, ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化(Matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)技術(shù)的發(fā)展，以ESI和MALDI為基礎(chǔ)的MALDI-MS技術(shù)解決了質(zhì)譜對(duì)生物分子進(jìn)行空間定位分析的問(wèn)題，該技術(shù)能有效地通過(guò)生物分子的離子化，檢測(cè)其在組織樣品中的準(zhǔn)確位置。MALDI-MS在化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著重大的作用，對(duì)于研究動(dòng)植物體內(nèi)、外特異性分子的分布有巨大的前景。質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于其精確性，而MALDI加快了檢測(cè)的速度，MALDI-MS則是集兩者于一身的具有高速率、高精確度的檢測(cè)技術(shù)，且MALDI-MS能在飛摩（10～15）乃至阿摩（10～18）水平檢測(cè)相對(duì)分子量高達(dá)幾十萬(wàn)的生物大分子。

1 MALDI-MS的技術(shù)原理

MALDI-MS技術(shù)原理是在MALDI離子源部分，用激光照射在樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜上，基質(zhì)從激光中吸收能量并傳遞給樣品，使樣品中的分子形成質(zhì)子化、堿金屬加成的（M+H）+、（M+Na）+、（M+K）+或脫氫得到（M-H）+等系列準(zhǔn)分子離子，形成的離子在質(zhì)譜系統(tǒng)中得以分離和檢測(cè)的過(guò)程。

MALDI-MS基本工作流程大體包括4部分：樣品切片的制備、基質(zhì)體系的確立與覆蓋、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理，其中基質(zhì)體系及其覆蓋方式是MALDIMS的關(guān)鍵部分，決定能否獲得高質(zhì)量的成像?；|(zhì)系統(tǒng)是能與樣品混合或包被的具有能量吸附作用的有機(jī)化合物溶液，常用的基質(zhì)有：α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA），二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB）和3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, SA）。SA和CHCA通常用于檢測(cè)高、中分子量的蛋白質(zhì)和肽段；DHB主要用于低分子量的檢測(cè)，包括：脂類、核酸和陽(yáng)離子代謝物；9-氨基吖啶（9-aminoacridine, 9-AA）適用于低分子量代謝物的分析，例如一些陰離子代謝物。

2 MALDI-MS的應(yīng)用

2.1 MALDI-MS在食品中的應(yīng)用

當(dāng)前食品安全越來(lái)越受到人們的重視，提高食品檢測(cè)、分析方法的準(zhǔn)確性和精確性十分重要。對(duì)于食品檢測(cè)，目前普遍、常用的檢測(cè)技術(shù)多為高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀或氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，主要分析食品中的化學(xué)成份，有助于觀測(cè)食物的功能性和安全性。但隨著食品檢測(cè)項(xiàng)目的擴(kuò)展和深入，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)對(duì)于研究動(dòng)植物食品中特異性分子的空間分部具有局限性。

MALDI-MS作為一種新型的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)有其他技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)：（1）樣品無(wú)需復(fù)雜的前期處理，如提取、純化、分離和標(biāo)記。（2）可清晰地觀察食品中化學(xué)、生物成份的空間分布。MALDI-MS技術(shù)已經(jīng)作為一種新手段應(yīng)用于食品檢測(cè)。

MALDI-MS屬于一種軟電離技術(shù)，更適用于混合物及生物大分子的測(cè)定，是檢測(cè)食品中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的重要手段。實(shí)驗(yàn)證明，MALDI-MS能有效的檢測(cè)新鮮牛奶中添加的奶粉成份和新鮮羊奶中牛奶的成份，可有效區(qū)分混合蛋白食品中不同的蛋白成份。MALDI-MS可以同時(shí)檢測(cè)食品中不同脂類的分布，Horn等研究發(fā)現(xiàn)：在MALDI-MS的幫助下，檢測(cè)到了甘油三酯和磷脂在棉籽中的分布；還清晰直觀的觀察到甘油三酯在牛油果果皮中的分布。Sroyraya通過(guò) MALDI-MS觀察到卵磷脂、甘油三酯和鞘磷脂在遠(yuǎn)洋梭子蟹眼柄中的分布。Zaima等通過(guò)MALDI-MS觀察到稻谷中溶血磷脂酰膽堿的具體分布，同時(shí)還從數(shù)據(jù)的角度解釋了釀酒過(guò)程中磨米步驟的重要性，而這一重要且不可缺少的釀酒步驟，在之前一直未被解釋清楚。

雖然MALDI-MS作為新型技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)存在的局限性，但其也并不是十全十美，在某些檢測(cè)領(lǐng)域仍有短板。Parisa A等發(fā)現(xiàn)MALDI-MS在檢測(cè)白霉乳酪中的桔青霉素時(shí)，基質(zhì)會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾，用13C作為內(nèi)標(biāo)，可減少基質(zhì)產(chǎn)生的干擾。

2.2 MALDI-MS在微生物中的應(yīng)用

自然界中，每種微生物均有其區(qū)別于其他種類的獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，且這種遺傳特性受外界環(huán)境條件等影響較小?；诩?xì)菌特異性蛋白分子的MALDI-MS技術(shù)是一種全新的微生物快速檢測(cè)和鑒定技術(shù)。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)將測(cè)得的蛋白質(zhì)和多肽按分子量大小排列，形成獨(dú)特的蛋白質(zhì)組指紋圖，通過(guò)特征性的模式峰可進(jìn)行菌株的鑒定。

近年來(lái)，西方國(guó)家的MALDI-MS技術(shù)在微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)學(xué)者們也逐漸重視MALDI-MS在食品微生物鑒定分型方面的應(yīng)用。MALDI-MS在鑒定食品微生物（如，細(xì)菌、酵母菌和大腸桿菌）方面，操作步驟包括：樣品準(zhǔn)備、點(diǎn)樣、質(zhì)譜分析，通過(guò)質(zhì)譜圖與Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)分析，即可獲得鑒定報(bào)告。MALDI-MS最大的優(yōu)勢(shì)在于：在鑒定過(guò)程中，能進(jìn)行圖像觀測(cè)、實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析，而且數(shù)據(jù)能同時(shí)批量化處理和編輯，大大縮短了鑒定菌種的時(shí)間。

MALDI-MS還廣泛用于食源性致病菌的快速鑒定。該方法比傳統(tǒng)的鑒定方法速度快，并克服了分子生物學(xué)方法不能鑒定到種水平、易污染和易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的缺陷。同時(shí)MALDI-MS技術(shù)也已經(jīng)運(yùn)用于食品微生物分型和溯源分析上，王耀等人建立單增李斯特氏菌的MALDI-MS快速鑒定和分型方法，并對(duì)建庫(kù)菌株進(jìn)行同源性分析，為追蹤食源性的病菌污染源提供技術(shù)支持。

MALDI-MS能快速鑒定單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）； 在 沙 門(mén) 氏 菌（Salmonella sp．） 的血清分型中表現(xiàn)出較好的能力；對(duì)于脆弱擬桿菌（b．fragilis）鑒定與生化測(cè)試方法相比，MALDI-MS鑒定的能力更高、準(zhǔn)確性更好；在阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）等病原菌的快速鑒定應(yīng)用方面取得很好的效果；以及對(duì)于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、鑒別和分類都比較困難的梭菌，MALDI-MS技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確的鑒定。非發(fā)酵菌是人體的機(jī)會(huì)致病菌，如今已成為院內(nèi)感染的重要致病菌，而傳統(tǒng)表型鑒定方法常出現(xiàn)誤診，MALDI-MS技術(shù)在鑒定非發(fā)酵菌方面已表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性。在植物細(xì)菌鑒定領(lǐng)域，MALDI-MS可以有效鑒定多種生態(tài)地區(qū)來(lái)源的枯萎癥病原，還可以用于細(xì)菌屬的鑒定。

2.3 MALDI-MS在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

MALDI-MS在臨床上也展現(xiàn)其實(shí)用性，MALDIMS可同時(shí)分析組織中成千上萬(wàn)的蛋白質(zhì)分布的空間位置，但不需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

激光共聚焦掃描顯微技術(shù)通過(guò)染色技術(shù)，可在亞細(xì)胞水平觀察蛋白質(zhì)等分子的變化，但對(duì)未知蛋白質(zhì)等鑒定很難。但是以MALDI-MS為基礎(chǔ)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDITOF-MS)，通過(guò)直接掃描生物樣品，能研究蛋白質(zhì)等分子在細(xì)胞或組織中的分布，或鑒定細(xì)胞中的特征分子，從而可將疾病的發(fā)生部位、進(jìn)程與相關(guān)分子緊密聯(lián)系起來(lái)；另一方面，MALDI-MS可準(zhǔn)確顯示藥物及其代謝產(chǎn)物在組織中的分布，揭示它們?cè)隗w內(nèi)的位置和生物轉(zhuǎn)化途徑。Khatib-Shahidi等已把基于MALDI-MS的質(zhì)譜成像方法應(yīng)用于生物藥劑學(xué)中，將單一的器官組織分析進(jìn)一步發(fā)展到了整體組織中。

另外，研究證明MALDI-MS在臨床上可輔助尋找機(jī)體潛在的生物標(biāo)志物，為疾病臨床的早期診斷提供參考依據(jù)；并能夠在組織中研究潛在生物標(biāo)志物的空間分布及表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)，在癌癥診斷、病程監(jiān)控、外科切除有效性評(píng)價(jià)中具有重要價(jià)值。Skold等利用MALDI-MS分子成像技術(shù)，在小鼠模型中尋找帕金森病的生物標(biāo)志物。MALDI-MS用于組織成像是一種全新的分子成像技術(shù)，它不局限于特異的一種或者幾種分子，它可在組織切片中同時(shí)找到多種分子，并提供這些分子在組織中空間分布的精確信息，同時(shí)可對(duì)這些蛋白質(zhì)分子的含量進(jìn)行相對(duì)定量。Stoeckli等第一次證明MALDI-MS在病理學(xué)研究中適用，獲得惡性膠質(zhì)瘤中不同蛋白的不同分布的影像。與其他檢測(cè)方式相比，MALDI-MS還較多用于單核苷酸多態(tài)性的分型研究上。

MALDI-MS在機(jī)體過(guò)敏原檢測(cè)方面，在建立肽段識(shí)別和臨床過(guò)敏原之間的相關(guān)性領(lǐng)域都有重要意義。從而可提升臨床上過(guò)敏原的診斷方法、判斷標(biāo)準(zhǔn)和有效的治療手段，是MALDI-MS在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有待發(fā)展的方向。

3 發(fā)展前景

雖然MALDI-MS在醫(yī)學(xué)、生物、分析化學(xué)等領(lǐng)域有了不小的發(fā)展，但仍存在許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)尚待解決。例如：基質(zhì)種類選擇性??；基質(zhì)有可能帶來(lái)檢測(cè)的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；優(yōu)秀的質(zhì)譜圖像自動(dòng)化分析軟件以及不同組織樣本之間差異分子比較分析所必需的統(tǒng)計(jì)軟件還亟待開(kāi)發(fā)；在如何處理大量質(zhì)譜數(shù)據(jù)并給出可用于臨床的診斷分析結(jié)果上，還未形成共識(shí)；在獲取生物組織中小分子化合物的信息時(shí)，還必須使用多級(jí)串聯(lián)的質(zhì)譜分析器等。

隨著質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)科學(xué)和生物信息學(xué)等生命科學(xué)關(guān)鍵領(lǐng)域的發(fā)展，MALDI-MS技術(shù)將有可能在功能基因組學(xué)、臨床蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)等方面發(fā)揮巨大作用，并將在食品、環(huán)境檢測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)、新藥開(kāi)發(fā)等眾多科學(xué)領(lǐng)域中作為新的實(shí)驗(yàn)手來(lái)段廣泛運(yùn)用。

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