HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA表達(dá)對(duì)胸腔鏡食管癌切除術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值研究

靳超，郎保平，張曉

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)市中心醫(yī)院 胸外科，河南 洛陽(yáng) 471002）

食管癌是臨床上較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率在全球范圍內(nèi)位居第4位，流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)每年有近15萬(wàn)人死于食管癌。早中期食管癌最佳的治療手段仍然是手術(shù)切除腫瘤組織。研究發(fā)現(xiàn)[1]，食管癌切除術(shù)后患者5年生存率為27%～42%。多種因素影響患者預(yù)后生存狀況，其中臨床分期、分化程度、腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等已被認(rèn)為與患者預(yù)后不佳、甚至死亡有關(guān)。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是目前第一被發(fā)現(xiàn)反式作用的lncRNA，且該RNA參與肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可作為腫瘤早期診斷以及預(yù)后判斷的一個(gè)新的分子標(biāo)志物[2-3]，但是該基因?qū)κ彻馨┣谐g(shù)后復(fù)發(fā)、患者預(yù)后生存情況的預(yù)測(cè)作用在國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。本研究旨在探討HOTAIR表達(dá)與胸腔鏡食管癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后生存之間的關(guān)系，從而為臨床選擇合適的治療手段提供依據(jù)，也為臨床研發(fā)新的靶向藥物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年4月-2014年4月在本院接受手術(shù)治療的食管癌患者92例作為研究對(duì)象。其中，男性69例，女性23例；年齡42～71歲，平均（61.29±7.89）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)纖維內(nèi)鏡行組織病理學(xué)檢查確診為食管癌；②術(shù)前經(jīng)頸部彩超、胸部CT掃描等檢查確診臨床分期在T3N1M0以?xún)?nèi)；③食管鋇餐造影顯示食管腫瘤直徑在5 cm以?xún)?nèi)并無(wú)軟組織陰影，若＜5 cm則以食管腔內(nèi)生長(zhǎng)為主，如腔內(nèi)型、蕈傘型；④未出現(xiàn)頸部淋巴腫大以及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，無(wú)腫大融合的縱隔淋巴結(jié)；⑤心肺功能良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有胸腹手術(shù)史、放化療史；②有嚴(yán)重心肺功能不全、不能耐受長(zhǎng)時(shí)間麻醉者，或者近4周內(nèi)出現(xiàn)心絞痛；③癲癇發(fā)作、近期出現(xiàn)心肌梗死或者休克、嚴(yán)重甲狀腺功能亢進(jìn)或者胸腔感染所致的胸膜肥厚等；④高血壓患者。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料的收集收集患者主要臨床資料有：年齡、性別、腫瘤位置、臨床分期、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后是否進(jìn)行輔助放化療等。

1.2.2 胸腔鏡食管癌切除術(shù)術(shù)前行常規(guī)手術(shù)準(zhǔn)備，采用靜脈復(fù)合麻醉，經(jīng)雙腔氣管插管，從而保證右胸手術(shù)能夠正常操作?；颊呦热∑脚P位，于上腹正中切長(zhǎng)約12 cm切口，以便游離胃大、小彎以及腹段部分食管，將胃大彎側(cè)網(wǎng)膜右側(cè)血管弓保留，清掃胃左動(dòng)脈旁以及賁門(mén)旁脂肪淋巴組織，離斷賁門(mén)部位食管-胃組織，將胃-賁門(mén)斷端縫合，將胃底縫合牽引線連接至遠(yuǎn)端食管，擴(kuò)張食管裂孔，以便胃牽入胸腔或者與頸部吻合，待上述步驟完成后，將患者置于左側(cè)臥位、前傾15°，胸壁前消毒，重新鋪巾，左肺通氣。于腋后線第6肋間切1.5 cm切口并置入胸腔鏡，在腋后線第8肋間切1.5 cm切口、腋中線第5肋間切1.5 cm切口作為主操作孔、在鎖骨中線第4肋間做1 cm切口作為肺牽拉孔，在腋前線第3肋間作1 cm切口作為食管牽拉孔或吸引孔。將食管縱隔胸膜切口后，采用7號(hào)線結(jié)扎同時(shí)配合鈦夾鉗閉并縫合血管，離斷奇靜脈。牽引食管，采用電分離鉤或者超聲刀將全胸段食管及食管滋養(yǎng)血管游離，清掃氣管旁、上腔靜脈旁、右支氣管隆凸下、下肺靜脈旁淋巴結(jié)。所有受試對(duì)象均未處理胸導(dǎo)管，其中52例患者行右胸頂吻合、40例行右頸部吻合。術(shù)后需要給予抗炎、補(bǔ)液、化痰以及常規(guī)鎮(zhèn)痛。術(shù)后第2天經(jīng)空腸管實(shí)施腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，協(xié)助患者咳嗽排痰。1周后行上消化道造影，觀察是否出現(xiàn)吻合口瘺情況發(fā)生。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)組織中HOTAIR表達(dá)術(shù)后取受試對(duì)象癌組織及癌旁組織各50 mg，術(shù)后患者給予放化療，于化療后1年內(nèi)到醫(yī)院復(fù)診，采用纖維內(nèi)鏡取組織進(jìn)行檢查，了解患者是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)，將所得組織分為術(shù)后輔助放化療組和術(shù)后未放化療組。經(jīng)液氮吹吹打呈成粉末狀，加入Trizol試劑提取組織中的RNA，將提取的RNA樣品經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度，而后行逆轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照Prime-ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）執(zhí)行各項(xiàng)操作，反應(yīng)條件為：30℃ 10 min，56℃40 min，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增則按照SYBR Green說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系：25 μl，其中含有2.5 μl的10×緩沖液、1.5 μl氯化鎂（濃度為25 mmol/L）、2 μl的 dNTP（濃度為 2.5 mmol/L）、PCR引物各1.25 μl、DNA 模板 2 μl，0.5 μl Tag DNA 合成酶，剩余加上雙蒸水至25 μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 30 s，56℃退火 40 s，73℃延伸 30 s，共39個(gè)循環(huán)，最后73℃延伸5 min。每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)管。目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct表示。

1.2.4 隨訪所有受試對(duì)象均采用電話詢(xún)問(wèn)、門(mén)診隨診等方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2017年5月1日，中位隨訪時(shí)間為48個(gè)月，隨訪主要詢(xún)問(wèn)患者并發(fā)癥、生活狀況、術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)以及5年內(nèi)的生存情況等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0和Excel 2010統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用ROC曲線分析HOTAIR表達(dá)對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的預(yù)測(cè)價(jià)值，用Kaplan-Meier法制作生存曲線，采用Long-rank χ2檢驗(yàn)，影響因素的分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，癌組織HOTAIR相對(duì)表達(dá)量為（0.673±0.076），而癌旁組織為（0.387±0.058），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.923，P=0.000），見(jiàn)圖1。不同臨床分期、分化程度、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的HOTAIR表達(dá)有差異，見(jiàn)表1。術(shù)后1年內(nèi)，92例患者中有68例患者愿意到醫(yī)院復(fù)診，提取病理組織復(fù)檢，其中39例為術(shù)后輔助放化療，29例為術(shù)后未放化療，其中術(shù)后放化療組HOTAIR相對(duì)表達(dá)量為（0.471±0.092），而未放療組為（0.746±0.103），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.709，P=0.000）。

2.2 HOTAIR表達(dá)水平與食管癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

圖1 食管癌患者術(shù)后癌組織及癌旁組織中HOTAIR表達(dá)

研究結(jié)果顯示，術(shù)后3年內(nèi)，HOTAIR相對(duì)表達(dá)量≤0.5組（41例）復(fù)發(fā)率29.27%低于HOTAIR相對(duì)表達(dá)量 ＞0.5組（51例）的 56.86%（χ2=7.005，P=0.008），而平均復(fù)發(fā)時(shí)間≤0.5組為（29.32±4.57）個(gè)月，高于HOTAIR相對(duì)表達(dá)量＞0.5組的（21.22±6.09）（t=7.094，P=0.003）。

2.3 HOTAIR表達(dá)對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線結(jié)果顯示，HOTAIR表達(dá)對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值：敏感性為0.797，特異性為0.816，曲線下面積（area under the curve，AUC）為 0.727（95%CI：0.684，0.884），見(jiàn)圖2A；HOTAIR表達(dá)對(duì)術(shù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值：敏感性為0.813，特異性為0.838，AUC為0.769（95%CI：0.692，0.901）。見(jiàn)圖 2B。

表1 HOTAIR表達(dá)與臨床因素的關(guān)系 （±s）

表1 HOTAIR表達(dá)與臨床因素的關(guān)系 （±s）

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2.4 食管癌切除術(shù)患者臨床資料與生存率關(guān)系的單因素分析

研究結(jié)果顯示，食管癌切除術(shù)后患者3及5年的生存率分別為57.61%和42.39%。經(jīng)單因素分析顯示，腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、術(shù)后輔助放化療以及HOTAIR表達(dá)量升高均為術(shù)后患者3及5年生存率的影響因素。見(jiàn)表2和圖3。

圖2 HOTAIR表達(dá)對(duì)食管癌術(shù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

表2 食管癌切除術(shù)患者臨床資料與生存率關(guān)系的單因素分析

續(xù)表2

2.5 食管癌切除術(shù)預(yù)后多因素分析

以預(yù)后5年生存情況為因變量（0為生存，1為死亡），經(jīng)單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量，做一般多因素Cox生存分析，結(jié)果顯示分化程度、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HOTAIR相對(duì)表達(dá)量為預(yù)后的危險(xiǎn)因素，而術(shù)后輔助放化療為預(yù)后的保護(hù)因素，見(jiàn)表3和圖3。

表3 食管癌切除術(shù)預(yù)后多因素Cox生存分析相關(guān)參數(shù)

圖3 不同臨床因素對(duì)食管癌術(shù)后生存率的影響

3 討論

胸腔鏡食管癌切除術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)食管癌切除術(shù)避免對(duì)背闊肌、前鋸肌以及肋間肌等肌群的傷害，能夠完整的保持胸廓，減少手術(shù)所造成的創(chuàng)傷以及完整保留患者的呼吸功能。國(guó)內(nèi)外有研究顯示[4-5]，采用胸腔鏡輔助切除術(shù)與傳統(tǒng)手術(shù)比較，近期療效更為顯著，而遠(yuǎn)期療效兩種手術(shù)基本相當(dāng)。病灶組織切除范圍以及淋巴結(jié)清掃狀況是影響食管癌患者預(yù)后的重要因素。胸腔鏡輔助手術(shù)擴(kuò)大手術(shù)的視野，術(shù)者以及助手能夠跟清晰的分辨食管周?chē)慕M織結(jié)構(gòu)，充分暴露中各內(nèi)淋巴結(jié)、尤其是雙側(cè)喉返神經(jīng)的暴露較常規(guī)手術(shù)更為清晰，研究甚至指出，胸腔鏡手術(shù)在清掃淋巴結(jié)方面完全達(dá)到開(kāi)放手術(shù)的效果，而在局部淋巴結(jié)清掃方面效果甚至優(yōu)于開(kāi)放手術(shù)。此外，有研究指出[6]，胸腹腔鏡食管癌切除手術(shù)在減小創(chuàng)傷、并發(fā)癥、腫瘤切除及淋巴結(jié)清掃等方面與傳統(tǒng)手術(shù)方法基本相當(dāng)；有研究顯示，胸腔鏡手術(shù)患者總胸引流量以及胃液引流量低于傳統(tǒng)手術(shù)，且無(wú)明顯的肺部并發(fā)癥，隨著胸腔鏡手術(shù)的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯，國(guó)內(nèi)開(kāi)展該手術(shù)治療早中期食管癌的臨床報(bào)道越來(lái)越多。

影響癌癥術(shù)后預(yù)后因素主要涵蓋以下幾方面：一般臨床資料（如性別、年齡及生活習(xí)慣等）、臨床病理因素及術(shù)者操作因素。臨床研究發(fā)現(xiàn)[7]，食管癌患者多數(shù)為男性，且預(yù)后女性多優(yōu)于男性，但進(jìn)一步研究卻發(fā)現(xiàn)預(yù)后男女性別之間并無(wú)差異，該結(jié)論說(shuō)明雌激素對(duì)食管癌的生長(zhǎng)有抑制作用，該機(jī)制有待進(jìn)一步考證，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)入選的92例患者中69例為男性，但進(jìn)一步研究顯示，兩者在5年內(nèi)生存率并無(wú)差異，提示性別對(duì)預(yù)后并無(wú)影響。目前對(duì)于年齡是否影響食管癌預(yù)后尚不能確定，有研究指出[8]，年齡在60歲以上人群，因機(jī)體新陳代謝下降、免疫功能降低、術(shù)后機(jī)體恢復(fù)能力弱，其預(yù)后差，但也有研究發(fā)現(xiàn)年齡越大患者預(yù)后更好，其認(rèn)為年輕患者癌細(xì)胞活性更強(qiáng)、惡性細(xì)胞增殖更快，預(yù)后差，當(dāng)然也有一部分研究指出年齡對(duì)食管癌術(shù)后預(yù)后并無(wú)影響，本研究未發(fā)現(xiàn)年齡對(duì)胸腔鏡食管癌切除術(shù)預(yù)后有影響，筆者認(rèn)為目前對(duì)于年齡是否影響食管癌手術(shù)預(yù)后，其存在的爭(zhēng)議主要可能緣于以下幾點(diǎn)：①入選時(shí)不同年齡段患者身體狀況、免疫功能等存在一定差異，其有可能對(duì)預(yù)后造成一定的影響；②不同年齡段患者在入選時(shí)臨床分期、腫瘤侵及深度等也可能干擾年齡這一因素的影響作用。臨床研究單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤位置與患者預(yù)后有關(guān)，但多因素顯示腫瘤位置與預(yù)后無(wú)關(guān)，通過(guò)本研究單因素結(jié)果顯示，食管癌位置與預(yù)后無(wú)關(guān)，其原因可能在于：①病灶位于食管上段患者的例數(shù)較少，統(tǒng)計(jì)時(shí)易出現(xiàn)偏差；②術(shù)者的準(zhǔn)確操作有關(guān)。食管癌患者細(xì)胞的分化程度反映腫瘤細(xì)胞的惡性病變程度，分化程度越低，則惡性程度越高，腫瘤分化程度與食管癌預(yù)后的相關(guān)性已經(jīng)得到多數(shù)學(xué)者的普遍認(rèn)可[9]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移已經(jīng)被多數(shù)認(rèn)為與食管癌預(yù)后存在相關(guān)性。臨床分期是食管癌預(yù)后的重要影響因素，目前，根據(jù)腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移等組合的TNM分期是選擇合適的治療方案、評(píng)價(jià)治療效果以及評(píng)估患者預(yù)后的重要依據(jù)[10]，臨床分期對(duì)食管癌患者預(yù)后具有重要影響，一項(xiàng)研究顯示臨床病理分期每增加一期，死亡的危險(xiǎn)增加多倍[11]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論單因素分析還是多因素回歸分析，均顯示腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期均為患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，這與部分的臨床研究報(bào)道基本一致。

HOTAIR是lncRNAs家族中重要的一員，其主要位于人類(lèi)第12號(hào)染色體HOXC12基因與HOXC11基因之間，其已經(jīng)被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌患者病灶組織中表達(dá)量高于癌旁組織、正常組織；另有體外研究發(fā)現(xiàn)[12]，通過(guò)下調(diào)HOTAIR可以增加肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；國(guó)內(nèi)也有研究指出[13]，HOTAIR表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌臨床分期、分化程度以及腫瘤大小存在相關(guān)性，且HOTAIR高表達(dá)患者生存期短。需要指出的是，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于HOTAIR表達(dá)是否影響食管癌預(yù)后的報(bào)道較少。通過(guò)本研究顯示，HOTAIR與食管癌患者臨床分期、分化程度、腫瘤大小等相關(guān)，需要提出的是術(shù)后輔助化療患者HOTAIR降低，提示術(shù)后輔助放化療可能通過(guò)抑制HOTAIR表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR與患者術(shù)后復(fù)發(fā)存在相關(guān)，低表達(dá)HOTAIR患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)率低于高表達(dá)組，且復(fù)發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，通過(guò)生存曲線以及Cox模型分析顯示，HOTAIR表達(dá)與食管癌患者預(yù)后存在相關(guān)，提示HOTAIR與胸腔鏡食管癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)、生存率存在相關(guān)，為患者預(yù)后危險(xiǎn)因素。筆者認(rèn)為，食管癌患者在手術(shù)后通過(guò)檢測(cè)HOTAIR表達(dá)，從而對(duì)患者預(yù)后提供一定的臨床參考，也為臨床醫(yī)師選擇更為合適的治療方案以及臨床效果評(píng)估提供一定的依據(jù)，同時(shí)筆者認(rèn)為，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更為有效的靶向分子藥物治療提供方向。

綜上所述，HOTAIR為胸腔鏡食管癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)、生存狀況的影響因素，通過(guò)對(duì)HOTAIR的檢測(cè)可以為臨床選擇合理的治療方案提供參考依據(jù)。

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