GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387單核苷酸多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性研究

周爽，尤昕

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 延吉 133000）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CAD）（簡(jiǎn)稱冠心病）是1種全球范圍內(nèi)常見的慢性病，已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的最主要病因之一。冠心病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為受環(huán)境和遺傳兩大因素的共同影響，隨著分子遺傳生物學(xué)的迅速發(fā)展，對(duì)其遺傳因素方面的研究也越來越受到重視[1]。自人類基因組計(jì)劃實(shí)施以來，人們對(duì)冠心病有更加深入了解，文獻(xiàn)表明，遺傳因素在冠心病發(fā)病過程中的貢獻(xiàn)高達(dá)50%[2]。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association studies，GWAS）被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜多基因疾病的研究之中，以單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）為基礎(chǔ)的全基因組關(guān)聯(lián)分析已成為研究冠心病遺傳易感性的主流方法，通過該方法研究發(fā)現(xiàn)的冠心病相關(guān)基因位點(diǎn)已達(dá)50多個(gè)[3]。GUCY1A3基因位于4號(hào)染色體q32.1，長(zhǎng)77353 bp，含有13個(gè)外顯子，編碼690個(gè)氨基酸，這些氨基酸組成可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）的(α1亞基。GUCY1A3基因已被認(rèn)為在CAD的高遺傳風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮著重要作用[4]?？扇苄曾B苷酸環(huán)化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）作為1種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶廣泛分布于人體中，并介導(dǎo)心血管系統(tǒng)的許多生理過程，例如促進(jìn)血管平滑肌舒張，抑制血小板聚集和血管重構(gòu)等，因此sGC成為維持心血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶[5]。該試驗(yàn)選取GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387進(jìn)行研究，分析其單核苷酸多態(tài)性與延邊地區(qū)漢族人群CAD遺傳易感性之間的關(guān)系，為開展針對(duì)性的人群預(yù)防提供新線索，同時(shí)也為延緩或防止CAD的發(fā)生提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取延邊大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院且相互之間無血緣關(guān)系的漢族冠心病患者204例，均符合世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)至少1支冠脈狹窄≥50%。對(duì)照組201例選自延邊大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢科體檢結(jié)果正常，且通過詢問病史、輔助檢查等明確排除心血管疾病的健康人。通過查閱病案資料、問卷訪談等形式收集研究對(duì)象的基本資料及既往病史等，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒（美國Promega公司），SNaPshot試劑盒：ABI PRISM SNa Pshot Multiplex Kit（美國ABI公司），Taq酶：KAPA Taq Hot Start DNA Polymerase（Kapabiosystems公司），SAP 酶（Fermentas公司）、ExoI酶和CIP酶（NEB公司），瓊脂糖（美國Invitrogen公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

Beckman Allgre 21R高速冷凍離心機(jī)（Beckman公司），BC-subMIDI電泳儀（北京六一儀器廠），JY300 C電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），Bio Sens SC 810B凝膠成像儀（上海山富科學(xué)儀器有限公司），PTC-100PCR儀（MJ公司），ABI 9700擴(kuò)增儀（ABI公司），3730XL測(cè)序儀（美國ABI公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

研究對(duì)象的GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的基因型及等位基因的檢測(cè)過程主要包括設(shè)計(jì)合成引物、提取DNA、預(yù)擴(kuò)增、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化、延伸反應(yīng)、延伸產(chǎn)物純化、上機(jī)檢測(cè)及整理分析數(shù)據(jù)。根據(jù)Genbank獲得的GUCY1A3基因所在序列的信息，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)rs7692387位點(diǎn)的特異性引物。正向引物：5'-CACTTCACTGTGGAAAC（C/T）GAG-3'，反向引物：5'-GTGCCTACAATGATGCCTGG-3'。入選的研究對(duì)象均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血2 ml于抗凝管中，室溫?fù)u勻后置-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，采用DNA提取試劑盒按使用說明書提取并純化DNA。以聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增含有目的位點(diǎn)的基因片段。PCR反應(yīng)體系包含提取 DNA（10～20 ng/μl）2 μl，2.5×BufferⅣ 4.0 μl，Taq（5 u/L）0.15 μl，引物（5 μmol，F(xiàn)+R）1.5 μl，加去離子水至10 μl。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢。將所得產(chǎn)物用ExoI酶消化后純化再加入延伸體系，延伸體系包括消化后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1.2 μl，Primers Mix 2 μl，ABI Mix 0.5 μl，10×Buffer I 0.4 μl，加去離子水至5 μl。將所得延伸產(chǎn)物純化后加入3730XL測(cè)序儀，采用美國ABI公司開發(fā)的Sna Pshot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)是基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的1種分型技術(shù)。最后應(yīng)用分析軟件將檢測(cè)所得的原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行整理分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。兩組研究對(duì)象的基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)其是否具有群體代表性。等位基因頻率及基因型頻率分布差異情況采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。應(yīng)用Logistic回歸分析校正混雜因素對(duì)冠心病的影響，并計(jì)算值和95%可信區(qū)間（95%CI），以檢測(cè)GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387單核苷酸多態(tài)性和冠心病的相關(guān)性，以雙側(cè)P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般臨床資料比較

冠心病組和對(duì)照組在性別、年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、糖尿病史、TC及TG方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），研究對(duì)象平均年齡符合冠心病的高發(fā)年齡。冠心病組高血壓、吸煙史及LDL-C均高于對(duì)照組，HDL-C低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表 1。

表1 兩組的臨床資料比較

2.2 基因測(cè)序結(jié)果

研究對(duì)象的GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387共有3種基因型（見圖1）：純合子GG、AA，雜合子GA，純合子基因型顯示的峰型是單峰，雜合子基因型顯示的峰型是套峰。延伸體系中包含4種熒光標(biāo)記的ddNTP，分別用藍(lán)色、黑色、綠色、紅色代表延伸加入ddGTP、ddCTP、ddATP及ddTTP的延伸產(chǎn)物，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。

2.3 兩組GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387單核苷酸多態(tài)性與冠心病的關(guān)系

兩組分別進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，兩組研究對(duì)象GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387基因型頻率的觀察值與理論預(yù)測(cè)值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），表明該研究的人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387 G/A多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果顯示，冠心病組GG基因型頻率高于對(duì)照組，而對(duì)照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），G和A 2等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

2.4 GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的基因型與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

將研究對(duì)象作為整體進(jìn)行分析，以GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的基因型（GG=1，GA+AA=2）、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量，有無冠心?。ㄓ?1，無=0）作為因變量建立Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，排除可能與冠心病有關(guān)的一些混雜因素后，GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的GG基因型與GA+AA基因型比較，其可增加冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)2.327，P=0.039），表明GG基因型可能是冠心病發(fā)病的易感基因型。見表3。

圖1 GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的基因型測(cè)序結(jié)果

表2 GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387基因型頻率及等位基因頻率分布比較

表3 GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的基因型與冠心病的Logistic回歸分析

2.5 GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的等位基因與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

將研究對(duì)象作為整體進(jìn)行分析，以GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387 的等位基因（A=1，G=2）、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量，有無冠心?。ㄓ?1，無=0）作為因變量建立Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，排除可能與冠心病有關(guān)的一些混雜因素后，GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的A等位基因與G等位基因比較，其可降低冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)表明A等位基因可能是冠心病的保護(hù)性基因。見表4。

表4 GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的等位基因與冠心病的Logistic回歸分析

3 討論

冠心病是嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量的心血管疾病之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，如今已成為我國城鄉(xiāng)居民疾病死亡的首要原因[6]。冠心病是1種多基因疾病，遺傳因素對(duì)其發(fā)生和發(fā)展有影響，該基因的多態(tài)性和冠心病之間的關(guān)系是目前研究的主要方向?；蚨鄳B(tài)性反映基因的選擇性表達(dá)，是人類基因組在抵御不良環(huán)境影響過程中的1種適應(yīng)性表現(xiàn)，包括SNP、DNA重復(fù)序列多態(tài)性以及DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性，在疾病易感性和人體對(duì)疾病的抵抗力等方面發(fā)揮重要作用[7]。SNP是基因多態(tài)性中最常見的1種，已被列為對(duì)復(fù)雜性疾病產(chǎn)生影響的最主要因素之一[8]。已有研究證實(shí)，單個(gè)或多個(gè)基因的遺傳易感性會(huì)對(duì)CAD的發(fā)病產(chǎn)生直接影響，且不同地域、種族或同種族不同地域人口的CAD易感性具有差異[9]。全基因組關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到GUCY1A3基因座常見的非編碼區(qū)突變與CAD之間具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[10]。GUCY1A3基因是編碼sGC的α1亞基，sGC是NO-sGC-cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵酶，大部分以α1/β1異二聚體的形式廣泛分布于許多實(shí)質(zhì)臟器及各種組織細(xì)胞中[11]。當(dāng)體內(nèi)的sGC被NO激活，激活的sGC可以將GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，后者則作為細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)信息的傳遞者，介導(dǎo)舒張血管、降低血壓及促進(jìn)Na+排泄等正常生理活動(dòng)[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證明，若將大鼠的sGCα1、α2或sGCβ1基因敲除，其血管平滑肌舒張、血壓調(diào)節(jié)及血小板聚集等方面的功能均會(huì)較正常對(duì)照組產(chǎn)生不同程度的紊亂，部分會(huì)發(fā)生嚴(yán)重疾病，甚至死亡[13]。與之類似，心血管系統(tǒng)疾病患者體內(nèi)的NO-sGC-cGMP信號(hào)通路也常為紊亂狀態(tài)，其根本原因是NO在病理狀態(tài)下被清除，導(dǎo)致通路中最重要的第二信使cGMP無法被正常激活，從而不能發(fā)揮其正常生理功能[14]。綜上，NO-sGC-cGMP通路在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中顯得尤為重要，其將成為多種心血管系統(tǒng)疾病（如冠心病、心肌梗死、心力衰竭和慢性肺心病等）有效治療靶標(biāo)[15]。

本研究結(jié)果顯示，入選的研究對(duì)象基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所收集的樣本基本能代表延邊地區(qū)漢族人群GUCY1A3基因多態(tài)性分布。本研究中冠心病組GG基因型頻率高于對(duì)照組，而對(duì)照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組，有差異。應(yīng)用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓該混雜因素的作用后，有差異，與基因型為GA+AA者比較，基因型為GG者其患CAD的危險(xiǎn)性增加，表明GG基因型很可能是延邊地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)病的易感基因型。GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的A等位基因頻率分布在對(duì)照組中高于CAD組，而G等位基因頻率分布在CAD組中高于對(duì)照組，有差異。應(yīng)用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓及舒張壓該混雜因素的影響后，有差異，與攜帶G等位基因比較，攜帶A等位基因可降低冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)，表明A等位基因可能是延邊地區(qū)漢族人群冠心病的保護(hù)性基因。

本研究在一定程度上為冠心病易感人群的篩選及保護(hù)提供理論依據(jù)，從而根據(jù)不同個(gè)體的基因多態(tài)性實(shí)施針對(duì)性的早期干預(yù)，對(duì)冠心病的預(yù)防及個(gè)性化治療具有重要意義。同時(shí)由于國內(nèi)外對(duì)GUCY1A3基因位點(diǎn)rs7692387的研究較少，該試驗(yàn)的結(jié)果仍需在擴(kuò)大樣本含量的基礎(chǔ)上，對(duì)不同種族、不同地域的人群進(jìn)行更加深入的研究。

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