發(fā)酵乳桿菌PCC及干酪乳桿菌431對免疫低下型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用研究

陸文偉，陸靜，楊震南，丁歷偉，葉佳蓉，陳衛(wèi)

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214000；2.杭州味全食品有限公司，杭州310018）

0 引言

益生菌(Probiotics)是一類口服一定量后能夠?qū)λ拗鹘】稻哂写龠M作用的活體微生物，又被稱之為微生態(tài)制劑或活菌制劑[1]。目前，可作為益生菌的微生物主要包括乳酸菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、乳球菌、明串珠菌等多個菌屬。益生菌具有多種生物活性，包括防治便秘，調(diào)節(jié)消化道菌群平衡[2]；促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[3-4]；刺激機體的免疫系統(tǒng)，促進免疫功能成熟，提高機體的免疫防御機能[5]；預(yù)防和輔助治療抗生素引起的腹瀉等[6]。在上述生理活性中，增強宿主免疫防御機能則屬于益生菌在非消化系統(tǒng)中發(fā)揮的生理功能。

益生菌可通過局部免疫調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgA、IgG分泌，繼而提高其濃度，調(diào)節(jié)機體免疫或通過激活宿主巨噬細胞、T細胞、NK細胞、DC細胞等來增強機體的免疫[7]。例如，乳酸菌能夠促進T、B淋巴細胞增殖分化成漿細胞并產(chǎn)生IL-2、IL-10、IgA、IgG；并提高單核巨噬細胞的吞噬活性，誘導(dǎo)活性氧、溶酶體酶等分泌[8-9]。張志焱等報道指出，乳酸菌發(fā)酵上清液可促進肉仔雞的免疫器官發(fā)育，提高血清中IgG含量[10]。何穎等人研究發(fā)現(xiàn)微生態(tài)制劑NS復(fù)合乳酸菌可提高斷奶仔豬體液血清中IgM、IN F-γ含量，從而增強仔豬體液免疫[11]。李理等人研究發(fā)現(xiàn)，小鼠口服乳酸菌后會誘導(dǎo)由塵螨引起的氣道炎癥型小鼠的T細胞釋放IL-10，降低Th1/Th2水平[12]。因此，乳酸菌在增強機體或宿主細胞的免疫能力過程中，菌株可誘導(dǎo)TN F、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10產(chǎn)生，從而到增強免疫的效果[13-15]。

本研究依據(jù)環(huán)磷酰胺免疫抑制效果建立免疫功能低下小鼠模型，隨后分別口服益生菌株431和PCC 3周。根據(jù)試驗小鼠的免疫蛋白指標(biāo)IgM、IgG和細胞因子IL-6、IL-10、IL-17的變化及益生菌干預(yù)后小鼠上呼吸道菌群α、β多樣性，分析益生菌株干預(yù)對免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 實驗

1.1 材料與試劑

六周齡BALB/c小鼠40只(合格證號：SCXK（蘇）2017—0007，許可證號：SCYK（蘇）2017—0050)，購買于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。Lactobacillus fermentum PCC及Lactobacillus casei431；M RS培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；糞便基因組提取試劑盒(美國MP Biomedicals公司)；本研究所用引物購于生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)；RC BIOS 10型冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；FE-20型pH計(瑞士梅特勒-托利多公司)；MiSeq測序儀(美國Illumina公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

采用M RS液體培養(yǎng)基，37℃條件下靜止培養(yǎng)L.fermentumPCC及L.casei431，生長至穩(wěn)定前期時，室溫條件下5 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體沉淀用pH 7.4磷酸鹽緩沖液清洗后，制成5×108CFU/mL菌體懸液。

1.3.2 動物分組及處理條件

將BALB/c小鼠隨機平均分為4組：空白組、環(huán)磷酰胺對照組、環(huán)磷酰胺+PCC組、環(huán)磷酰胺+431組，4組小鼠適應(yīng)性1周后正式試驗。小鼠分組及口服菌株情況如表1所示，且試驗組小鼠灌胃劑量為

1.3.4 16S rRNA擴增分析

采用N anoD rop2000和瓊脂糖凝膠電泳評價宏基因組提取效果，通過引物341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)擴增細菌16S rRNA的V 3-V 4區(qū)域。并將PCR純化產(chǎn)物構(gòu)建M iSeq PE300測序文庫，通過M iSeq測序分析儀獲取序列信息，對序列Q 30/Q 20質(zhì)控分析，觀察試驗小鼠咽部菌群各分類學(xué)水平上的變化。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用Q IIM E(v1.9.0)分析平臺對質(zhì)控序列進行物種組成分析，并根據(jù)分組信息，進一步分析試驗組小鼠咽部菌群的α、β多樣性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中不同組之間的差異顯著性通過GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)判斷(Tukey’s檢驗)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

5×108CFU/mL。

1.3.3 免疫指標(biāo)的測定

采用ELISA法測定試驗小鼠外周血清中細胞因子及免疫球蛋白。

表1 小鼠分組情況

2.1 菌株P(guān)CC及431調(diào)節(jié)免疫低下型小鼠細胞因子水平

2.1.1 菌株P(guān)CC及431對促炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

益生菌攝入后會對宿主機體免疫細胞產(chǎn)生的一系列細胞因子產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，主要是通過影響宿主效應(yīng)細胞所產(chǎn)生的細胞因子來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用的[15-16]。促炎癥因子IL-6可誘導(dǎo)活化B淋巴細胞合成免疫球蛋白，增加免疫細胞IgA、IgG、IgM的分泌，亦可誘導(dǎo)T細胞的活化、增殖和分裂[17-19]。如圖所示，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫低下使得小鼠血清中IL-6、IL-17、TNF-α、IL-1β濃度均降低。其中，環(huán)磷酰胺組的IL-6含量由113.1±8.78 pg/mL下降至100.4±7.42 pg/mL；TNF-α的濃度則由518.8±27.05 pg/mL下降至468.2±36.58 pg/mL；同時，IL-1β的含量也由113.6±8.95 pg/mL下降至112.8±8.76 pg/mL。如圖2-A所示，較空白組而言，模型組IL-6的濃度降低(IL-6的濃度由113.1±8.78 pg/mL降低至100.4±7.42 pg/mL)；而干預(yù)組與模型組相比較，PCC組IL-6則由113.2±7.67 pg/mL恢復(fù)至空白組水平且具有顯著性差異(P＜0.01)。IL-17是Th17細胞分泌的一種促炎癥性細胞因子，在自身免疫性疾病中，均異常表達。IL-17可誘導(dǎo)炎癥因子以及趨化因子的表達，聚集較多的免疫細胞至炎癥部位加劇機體的炎癥反應(yīng)。圖1-B所示，PCC菌組的IL-17含量可由67.8±4.87 pg/mL恢復(fù)至79.9±5.95 pg/mL，且調(diào)節(jié)作用顯著(P＜0.01)。綜合圖1-C和1-D分析可知TN F-α表達水平在模型組與益生菌干預(yù)組間均無顯著性差異。

2.1.2 菌株P(guān)CC及431對抑炎癥性細胞因子的調(diào)節(jié)作用

圖1 小鼠血清促炎癥因子的濃度散點分布圖

TGF-β生物學(xué)功能主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)TGF-β對細胞的生長分化和免疫功能均具有重要的調(diào)節(jié)作用[20]。而對于益生菌干預(yù)免疫低下型小鼠TGF-β的分泌表達尚不清晰，因此本研究探討免疫低下小鼠TGF-β表達水平及與其它細胞因子水平的關(guān)聯(lián)性。如圖2-A所示，益生菌干預(yù)組與模型組相比較而言，TGF-β表達可恢復(fù)至空白組水平，其中PCC菌組含量可由181.5±15.16 pg/mL提高至216.5±15.63 pg/mL，431菌組則提高至 196.2±14.44 pg/m l，且PCC菌干預(yù)效果更顯著，由此可知，益生菌干預(yù)可促進抑炎癥因子的分泌，具有調(diào)節(jié)作用。

圖2 小鼠血清抑炎癥因子的濃度散點分布圖

IL-10是公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子。IL-10抑制單核巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)，抑制LPS和IFN-γ導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌。圖2-B所示結(jié)果表明，PCC菌、431菌組的IL-10的表達水平與模型組相比較，PCC菌組的IL-10濃度由570.8±44.34 pg/mL提高至646.9±48.63 pg/mL，431菌組則提高至670.6±48.95 pg/mL，且益生菌干預(yù)組組間差異顯著。同時，結(jié)合D圖所示可知，IFN-γ的分泌表達水平在干預(yù)組間無差異性，可能是IL-10的分泌表達抑制小鼠單核巨噬細胞所釋放的炎癥介質(zhì)，抑制IFN-γ的分泌表達。研究中PCC菌干預(yù)后，IL-2的表達水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，而431菌組較模型組分析可發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，趨勢同于空白組。

2.2 菌株P(guān)CC及431對小鼠免疫球蛋白的調(diào)節(jié)作用

免疫球蛋白是一類在外界或自身抗原物質(zhì)刺激下，宿主機體所產(chǎn)生的分布于宿主機體外周血、組織等具有相近構(gòu)造和抗體活性的物質(zhì)[23-24]。IgG是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75%。IgG在結(jié)合補體、增強免疫細胞吞噬病原微生物和中和細菌毒素的能力方面，具有重要作用[24]。

圖3 小鼠血清中免疫球蛋白的濃度散點圖

由圖3所示的IgM和IgG濃度變化可知，PCC菌和431菌對IgM的分泌均具有促進效果。PCC菌組小鼠血清中的IgM含量由51.2±3.86 pg/mL提高至60.8±3.86 pg/mL，433菌組IgM含量提高到55.9±2.80 pg/m l，且干預(yù)組組間差異顯著(P＜0.01)。試驗小鼠體液中的免疫因子IgG的在兩株益生菌株干預(yù)后，呈現(xiàn)出不同的現(xiàn)象。其中，PCC組的IgG濃度由296.6±32.42 pg/mL提高至360.7±19.63 pg/mL（P＜0.01），而431組濃度變化較模型組分析，差異不顯著。IgG、IgM的合成、分泌以及IgG、IgM介導(dǎo)的免疫應(yīng)答依賴于其它細胞輔助，主要是黏膜相關(guān)的淋巴組織的T細胞和其分泌的細胞因子。因此，益生菌干預(yù)時，小鼠血液中IgG、IgM的分泌水平與其它細胞因子間具有關(guān)聯(lián)性。

2.3 菌株P(guān)CC及431調(diào)節(jié)免疫低下小鼠上呼吸道菌群

2.3.1 免疫低下小鼠咽部菌群α多樣性

α多樣性可反映測定樣本內(nèi)微生物群落豐度及多樣性，依據(jù)其菌群計算指標(biāo)的不同反映其物種組成上的多樣性及豐富度。因此，本研究中采用Illumina MiSeq PE300測序儀分析益生菌干預(yù)免疫低下型小鼠其咽部菌群的變化情況。如圖4所示，豐度指數(shù)Cha01數(shù)值增大，則物種總數(shù)增多；且Simpson指數(shù)值隨測序深度增大，趨于平緩，說明本研究中測序數(shù)據(jù)合理。根據(jù)goods_coverage指數(shù)可反映出小鼠咽部微生物種屬多樣性在序列數(shù)達到20 000條時，其多樣性數(shù)據(jù)變化不大；基于PD—whole tree指數(shù)可反映出小鼠的咽部菌群的多樣性較高。

圖4 小鼠咽部菌群α多樣性各項指數(shù)

2.3.2 免疫低下小鼠咽部菌群屬水平上的變化

基于不同分類地位核心菌群相對含量的分析，使用Green genes數(shù)據(jù)庫對OTU代表性序列進行同源性比對分析，將所有序列依次鑒定至屬水平[25]?；趯偎骄旱谋容^分析可知，試驗組小鼠呼吸道菌群在其屬分類水平上的呈現(xiàn)出不同變化，其中免疫低下小鼠咽部優(yōu)勢菌群相對含量提高(A圖)。如B圖所示，相對豐度較高的菌屬為Allobaculum、Akkermansia、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等。其中，凝結(jié)桿菌屬的相對豐度變化在環(huán)磷酰胺組(42.79%)、PCC組(46.32%)顯著高于空白組，差異性顯著（P＜0.05）；Allobaculum屬在環(huán)磷酰胺組及干預(yù)組均顯著高于空白組；Akkermansia、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬所呈現(xiàn)出的變化是431菌組高于其它組。

2.3.3 免疫低下小鼠上呼吸道菌群β-多樣性

基于上述試驗組免疫小鼠屬分類水平初步可知，益生菌干預(yù)免疫低下小鼠的咽部微生物群落結(jié)構(gòu)不同。為進一步分析益生菌干預(yù)免疫低下型小鼠其咽部微生物群落結(jié)構(gòu)上的差別，依據(jù)測定樣品的OTU信息構(gòu)建非加權(quán)Unifrac距離矩陣，基于這一矩陣進行主坐 標(biāo) 分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)[26]。如圖6所示，主坐標(biāo)1及主坐標(biāo)2其解釋總變量的12.46%和4.34%，且基于OTU水平上，試驗組小鼠間的微生物群落呈現(xiàn)出不同分布，小鼠個體間差異較大，且不同組別間具有差異，相同組別間聚類。其中，口服PCC菌的小鼠較其它三個試驗組而言，區(qū)分度顯著；環(huán)磷酰胺對照組小鼠較空白組間而言，距離較遠，模型組小鼠咽部微生物菌群與正常組具有差異性；同時口服431菌組中部分小鼠菌群多樣性與空白組相近，由此可知免疫低下小鼠口服益生菌株可調(diào)節(jié)其咽部的菌群變化。

圖5 試驗組小鼠咽部菌群在屬水平上分布

圖6 小鼠咽部菌群PCoA分析圖

3 結(jié)論

益生菌株刺激機體的免疫系統(tǒng)，促進免疫細胞的成熟，提高機體的免疫防御機能。因此，外源性的攝入益生菌株對免疫抑制型宿主呈現(xiàn)出不同程度的調(diào)節(jié)效果[27]。本研究選用的益生菌株L.fermentumPCC及L.casei431對免疫低下型小鼠血清中部分促炎癥性及抑炎癥性細胞因子的分泌和免疫蛋白表達具有調(diào)節(jié)作用。同時，益生菌株干預(yù)后，小鼠咽部微生物群的多樣性趨勢同于空白組。上述分析結(jié)果表明，Lactobacillus.PCC及L.casei431對免疫低下小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)因免疫低下造成的菌群變化。因此，益生菌株P(guān)CC和431可作為潛在的免疫調(diào)節(jié)型菌株。

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