新疆發(fā)酵乳中保加利亞乳桿菌的耐藥性研究

任彩霞，郭慧玲，李麗娜，張文羿，孫天松

(內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室奶制品加工農業(yè)部重點實驗室，呼和浩特 010018)

0 引言

乳酸菌是人們認可的安全菌株，作為菌株發(fā)酵劑使用已有較長的歷史[1]。其定殖于人類及動物的胃腸道中，對人體具有重要的益生作用[2-5]。保加利亞乳桿菌是發(fā)酵酸乳的主要乳酸菌之一，最早由保加利亞人Stam en Grigorov發(fā)現[6]，具有多種生理功能[7]。目前，人們使用抗生素來治療細菌感染，部分細菌對其產生了耐藥性。研究者們最初只發(fā)現某些食源性致病菌具有抗生素耐藥性[8]，之后，在葡萄球菌和乳酸菌中也檢測到了抗生素耐藥基因[9]。近年來的研究表明，我們食品中使用的乳酸菌有的具有抗生素耐藥性，有的甚至攜帶抗生素耐藥基因[10-12]，部分耐藥基因還可能進行水平轉移[13-15]。保加利亞乳桿菌也不例外。AKPINAR[16]和SOZZ[17]報道，保加利亞乳桿菌對抗生素具有耐藥性，有的甚至具有多重耐藥性。

因此，為了判斷分離自新疆地區(qū)酸牛乳中保加利亞乳桿菌的安全性，本實驗采用肉湯稀釋法測定5株受試菌株在15種抗生素條件下的耐藥表型，并通過PCR手段對已報道的耐藥基因進行檢測。最終的實驗結果可能會對同行的乳酸菌抗生素耐藥性研究提供一定的參考。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 所用菌株與培養(yǎng)基

菌株：試驗菌株保加利亞乳桿菌IMAU 32265，IMAU 32166，IMAU 32276，IMAU 32071，IMAU 32330均分離自新疆的酸牛乳，由內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種保藏庫(LABCC)提供。

培養(yǎng)基：M RS broth（OXO ID，CM 0359），M RSagar（OXO ID,CM 0361），LSM 培 養(yǎng) 基[18]:90%IST（ISO-SENSITEST broth；OXO ID，CM 0473），10%MRSbroth。

1.1.2 所用抗生素及試劑

抗生素：四環(huán)素（tetracycline，TET），新霉素（neomycin，NEO），紅霉素（erythromycin，ERY），卡那霉素（kanamycin，KAN），環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP），鏈霉素（streptomycin，STR），利福平（rifampicin，R IF），克林霉素（clindamycin，CLI），氨芐西林（ampicillin，AM P），奎奴普丁/達福普?。╭uinupristin/dalfopristin，QU I/DAL），甲氧芐啶（trimethoprim，TRI），利奈唑胺（linezolid，LINE），慶大霉素（gentamicin，GEN），氯霉素（chloramphenicol，CHL），萬古霉素（vancomycin，VAN）。

試劑：生理鹽水，TE緩沖液，5×TBE電泳緩沖液貯液，0.5mol/L EDTA，10%SDS，3m ol/L NaAc，5 m ol/L N aC l，1%的瓊脂糖凝膠，酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，體積比），氯仿-異戊醇（24∶1，體積比），異丙醇，蛋白酶 K，dN TPs，10×PCR Buffer，Taq Polymerase，RNaseA，核酸染料等試劑，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.3 儀器

式中：Qk為單獨空氣源熱泵機組的額定制熱量，kW；K為富裕系數，取1.05；Ks為根據空氣源熱泵性能曲線在冬季空氣調節(jié)室外計算溫度(青島市為-7.2 ℃[14])，熱泵機組出水溫度45 ℃下的制熱量修正值，取0.79；Qg為單獨燃氣鍋爐的額定制熱量，kW.

冷凍離心機（5810R型），臺式高速離心機（TGL-16B型），微量紫外分光光度計（ND-1000型），全自動高壓蒸汽滅菌器（HA-300M），恒溫水浴鍋（HW S28型），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272型），UPV凝膠成像儀（GDS-8000型），電泳儀（DYY-12）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的制備及質控菌株的選取

取凍存管中的保加利亞乳桿菌，按1%接菌量活化于MRS液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫，培養(yǎng)24 h。之后將其劃線培養(yǎng)至M RS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫，培養(yǎng)48 h。挑取劃線培養(yǎng)后的單菌落于5 mL生理鹽水中，混勻，制成種子液，測定625 nm處菌株的OD值，直至OD值在0.16～0.2之間[19]（活菌數約為3×108mL-1）。

參照ISO 10932/IDF223，試驗選取Lactobacillus paracaseiATCC 334做質控菌，質控菌株可用于檢測試驗的精確度及準確度[20]。在試驗中，質控菌株的培養(yǎng)條件需嚴格控制。

1.2.2 抗生素溶液的制備

因為抗生素的溶解性不同，故抗生素溶液的制備分為水溶性和水不溶性兩種?？股氐呐渲迫軇┘皾舛确秶鷧⒄瘴墨I[20-21]。根據不同抗生素的濃度測定范圍，水溶性抗生素（LSM為溶劑）高濃度貯藏液需稀釋為2倍于對應濃度梯度的抗生素溶液。，而水不溶性抗生素根據對應溶劑溶解后，抗生素高濃度貯藏液需稀釋為10倍于對應濃度梯度的抗生素溶液,這與其溶劑的選擇有關。稀釋好的抗生素溶液置于-20℃保藏備用。

1.2.3 菌株耐藥性的表型分析

本試驗采用肉湯稀釋法測定保加利亞乳桿菌的M IC值，具體方法參考文獻[20]。

1.2.4 菌株全基因組DNA的提取DNA采[23]。用液氮凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組

1.2.5 菌株耐藥基因的檢測

將上述制備的基因組DNA作為PCR擴增的模板，根據已報道的抗生素耐藥基因設計引物，采用50μL反應體系進行擴增。組成為：10×easytaq Buffer 5μL、dN TPs 4μL、基因組DNA模板1.5μL、上下游引物各1.5μL，Taq Polymerase 0.5μL、滅菌去離子水加至50μL。PCR擴增循環(huán)參數如下：94℃預變性5 min；接著進行30個循環(huán)：94℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸2 min；最終72℃末端延伸10 min。所擴增耐藥基因的特異性引物序列及PCR退火溫度見表1。PCR擴增結束后通過1%的瓊脂糖凝膠對擴增產物進行檢測，并用凝膠成像儀分析結果。

2 結果與分析

2.1 菌株耐藥性的表型分析

本研究采用歐洲食品安全局[24]、歐盟委員會[25]共同制定的保加利亞乳桿菌臨界點的判定標準，分別將受試菌株的M IC值與臨界點進行比較，MIC值高于臨界點為耐藥（R），低于或等于臨界點則為敏感（S）。

試驗結果如表2所示，5株受試菌對慶大霉素、四環(huán)素、新霉素、紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、利福平、克林霉素、氨芐西林、奎奴普汀/達福普汀、甲氧芐啶、利奈唑胺、氯霉素、萬古霉素敏感，其MIC值表現為一定的差異，而且范圍較廣，從小于0.032～16μg/mL不等。5株受試菌對氨基糖苷類抗生素（慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素）的M IC值范圍為小于0.5μg/mL～16μg/mL；對萬古霉素的MIC值為小于其測定的最低濃度，即小于0.25μg/mL，表現出極強的敏感性；對紅霉素和利福平的MIC值分別為小于0.016μg/mL和小于0.125μg/mL。氯霉素對5株受試菌的抑制作用較低，MIC值為2μg/mL和1μg/mL，這一數據與KLARE[18]報道的結果相近。5株受試菌對氨芐西林的M IC值最高僅為0.064μg/mL，對甲氧芐啶的M IC值最高可達16μg/mL，這可能與氨芐西林和甲氧芐啶的結構不同有關?？胀?達福普汀和利奈唑胺對5株受試菌株的抑制程度接近，均在0.125～0.5μg/mL之間。對于四環(huán)素，除IMAU 32330的M IC值為小于0.125μg/mL外，其他菌株的M IC值均為0.5μg/mL。5株受試菌對環(huán)丙沙星的耐藥性存在明顯不同，IMAU 32071和IMAU 32276對環(huán)丙沙星敏感，而IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166對環(huán)丙沙星耐藥，且M IC值范圍較小，在2～16μg/mL之間。

2.2 菌株耐藥性的基因型分析

通過特異性引物PCR擴增技術對受試菌株的常見抗生素耐藥基因進行分析，統(tǒng)計結果如表3所示。5株受試菌均檢出了紅霉素耐藥基因erm（B），IMAU 32265還檢出了紅霉素耐藥基因erm（C），但表現為紅霉素敏感性。IMAU 32265、IMAU 32166、

IMAU 32276和IMAU 32071檢出了萬古霉素耐藥基因vanX，對萬古霉素表現為敏感；IMAU 32166、IMAU 32276和IMAU 32071檢出了利福平耐藥基因rpoB，卻表現為利福平敏感性；IMAU 32276還檢出了氯霉素耐藥基因cat，表現為氯霉素敏感性。受試菌株中，IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166雖表現為環(huán)丙沙星耐藥性，但并未檢出環(huán)丙沙星耐藥基因gyrA、parC。其它耐藥基因，如氯霉素耐藥基因catA、紅霉素耐藥基因erm(B)-1、萬古霉素耐藥基因vanE在菌株中均未檢出。除表4中所列基因在對應菌株中檢出外，與四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素相關的耐藥基因均未檢出。

表1 特異性引物序列及PCR退火溫度[21]

表2 5株保加利亞乳桿菌對15種抗生素的M IC分布結果

表3 保加利亞乳桿菌及耐藥性基因

3 討論

我國新疆地區(qū)地域遼闊，環(huán)境獨特，這里的少數民族牧民生產的發(fā)酵乳制品大多以牛乳、羊乳、馬乳和駱駝乳為原料，富含大量的有益乳酸菌[7]，保加利亞乳桿菌就是其中的代表。

本文研究的5株保加利亞乳桿菌均分離于新疆的酸牛乳，實驗測定受試菌株的M IC時采用了肉湯稀釋法，該方法是體外定量測定抗生素對細菌抑制活力的方法。測定過程中，不同濃度抗生素的液體培養(yǎng)基中加入定量的細菌，培養(yǎng)一定時間后，通過肉眼觀察判定MIC值。與濃度梯度法[26]（Etest）、紙片擴散稀釋法[27]（disk diffusion）、藥物敏感實驗[28]（Kirby-Bauer method）、微稀釋法[29]（microdilution）等相比，肉湯稀釋法操作方便，價格低廉，是實驗室普遍使用的判斷M IC的方法。之前的研究中，測定M IC所用的培養(yǎng)基為M RS培養(yǎng)基，但其結果的準確性備受質疑。HUYS[30]在用MRS與ISA（Iso-sensitest agar）培養(yǎng)基測定菌株的抗生素耐藥性時發(fā)現，兩種培養(yǎng)基條件下，同一菌株對慶大霉素的耐藥性有顯著差別，可能與M RS培養(yǎng)基中某些成分易與抗生素發(fā)生拮抗作用相關。隨著研究的深入，KLARE[18]發(fā)現LSM培養(yǎng)基能結合MRS和ISA兩種培養(yǎng)基的優(yōu)勢，并且能夠降低拮抗作用的發(fā)生概率，對于抗生素耐藥性檢測較準確，故一直應用于乳酸菌抗生素耐藥性研究中。

由于抗生素對細菌細胞的功能不同，目前已發(fā)現的抗生素可分為15類[11]。5株受試菌株對不同類的抗生素表現出不同的敏感性。對于能抑制核酸合成的利福平及環(huán)丙沙星，5株受試菌株的M IC值具有極大的差異。利福平對5株受試菌株具有敏感性，且抑制程度均相同，為小于0.125μg/mL。而5株受試菌株中，3株對環(huán)丙沙星耐藥，M IC值范圍在2～16μg/mL之間。Li等[31]所報道的環(huán)丙沙星耐藥率（68.3%）與本試驗結果接近。氯霉素、克林霉素、氨基糖苷類及四環(huán)素類抗生素雖均可抑制蛋白質的合成，但其敏感性存在區(qū)別。氯霉素與克林霉素相比，氯霉素對受試菌株的的耐藥性較高；氨基糖苷類抗生素對受試菌株的抑制作用相對較低，卡那霉素、鏈霉素及新霉素的耐藥性明顯高于慶大霉素，這可能與慶大霉素的結構有關，進而能較好的通過細菌細胞膜。對于抑制細菌細胞壁合成的抗生素，如氨芐西林和萬古霉素，5株受試菌株均表現出較強的敏感性。其中，氨芐西林的M IC值最高僅為0.064μg/mL，與周寧[32]得出的結果相似。NAW A[33]和郭慧玲[34]的報道中，保加利亞乳桿菌對萬古霉素100.0%耐藥，而試驗中5株受試菌株對萬古霉素均表現為敏感。顯然，這與之前報道的有關萬古霉素對乳酸菌作用機制的推斷[35]是不吻合的。

在耐藥基因檢測方面，通過比對耐藥基因PCR擴增產物，發(fā)現5株受試菌株檢出了耐藥基因erm(B)，IMAU 32265還檢出了紅霉素耐藥基因erm(C)，卻不具有紅霉素耐藥性。IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166具有環(huán)丙沙星耐藥性，卻未檢出耐藥基因gyrA等。在部分受試菌中也檢出了基因erm(C)、vanX等，但均無相關耐藥性。有文獻報道，分離自酸奶的乳酸桿菌表現為鏈霉素耐藥性，卻未檢出與鏈霉素相關的耐藥基因strA、strB、aadA等[1]；L.delbrueckii subsp.bulgaricus BFE 7430對氯霉素敏感，卻成功檢出了耐藥基因cat[36]。這均與本試驗結果較為相似。因此，菌株具有抗生素耐藥性，不一定能檢出與其耐藥性相關的耐藥基因；同樣的，菌株攜帶抗生素耐藥基因，不一定對該抗生素表現為耐藥。影響菌株耐藥性及耐藥基因檢出的因素有很多，歸納如下，（1）存在其他機制決定抗生素的耐藥性，例如編碼核糖體蛋白質或rRNA的基因發(fā)生突變[18]；（2）耐藥基因在RNA水平未發(fā)生表達[36]；（3）調節(jié)基因表達的核苷酸序列發(fā)生了基因突變[37]；（4）菌株對抗生素的耐藥性為固有耐藥性，其耐藥性由其它耐藥基因引起；（5）菌株的耐藥性來自于其它基因的水平轉移。到底是何種原因導致本試驗菌株出現以上情況，還需要我們進一步探究。

耐藥基因的水平轉移是影響食品安全的一大問題，致病菌和乳酸菌可通過基因的水平轉移獲得耐藥性[38-39]，任何攜帶耐藥基因的菌株都具有潛在的危害。因此，在對乳酸菌進行安全性評價時，除需檢測菌株在抗生素條件下的M IC值及耐藥基因外，還需進行耐藥基因轉移的判斷，確保其安全后方應用于發(fā)酵生產中。

4 結論

分離自新疆的5株保加利亞乳桿菌對15種常見不同抗生素的耐藥表型及基因型存在很大差異，且試驗菌株的耐藥表型與基因型間并非一一對應。IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166對環(huán)丙沙星耐藥，對其他抗生素敏感；IMAU 32071、IMAU 32276對所有抗生素均敏感。5株受試菌株都檢出了耐藥基因erm(B)，部分菌株還檢測到了vanX等，但5株菌均未檢出環(huán)丙沙星相關耐藥基因。因此，未來的研究中，菌株耐藥表型與基因型不匹配的作用機制有待進一步研究。

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