甲苯咪唑?qū)S河鯉過氧化氫酶活性的影響

郭國(guó)軍+弓飛龍+唐國(guó)盤+徐文彥+秦改曉+齊子鑫

摘要：為探討甲苯咪唑?qū)︴庺~的致毒機(jī)理，采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法，研究在不同暴露濃度（0、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/L甲苯咪唑）和不同暴露時(shí)間（24、72、120、168 h）下甲苯咪唑?qū)S河鯉（Cyprinus carpio L. var. haematopterus Temminck et Schlegel） 鰓、肝胰臟和腎臟里過氧化氫酶活性的影響。結(jié)果顯示，甲苯咪唑?qū)︴庺~過氧化氫酶活性具有明顯的誘導(dǎo)作用，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)，且隨濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，過氧化氫酶活性呈先升高、后降低的變化趨勢(shì)，特別是在暴露于甲苯咪唑72 h后，各處理濃度對(duì)黃河鯉鰓、肝胰臟和腎臟里過氧化氫酶活性的影響均達(dá)極顯著水平。甲苯咪唑引起黃河鯉中毒的主要靶分子可能是過氧化氫酶，過氧化氫酶活性可作為鯉魚甲苯咪唑中毒的指示指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：黃河鯉（Cyprinus carpio L. var. haematopterus Temminck et Schlegel）；甲苯咪唑；過氧化氫酶活性；鰓；肝胰臟；腎臟

中圖分類號(hào)：S965.116：S859.79+5：Q554+.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4830-03

黃河鯉（Cyprinus carpio L.var.haematopterus Temminck et Schlegel）是河南省一個(gè)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象，是河南省漁業(yè)產(chǎn)業(yè)的支柱之一。近年來，隨著黃河鯉養(yǎng)殖規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷提高和養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，養(yǎng)殖病害的頻繁發(fā)生給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)下滑。為了降低病害對(duì)黃河鯉養(yǎng)殖造成的損失，甲苯咪唑往往被用于治療黃河鯉的指環(huán)蟲、三代蟲等單殖吸蟲類寄生蟲病。然而，甲苯咪唑的過量使用也會(huì)對(duì)養(yǎng)殖水體造成污染，從而對(duì)黃河鯉產(chǎn)生毒害作用。目前有關(guān)甲苯咪唑?qū)︳~類的毒理作用報(bào)道很少，而且主要集中在半致死濃度、體內(nèi)藥物代謝及殘留消除的研究上[1-5]，尤其是對(duì)黃河鯉的研究甚少。過氧化氫酶（Catalase，CAT）是動(dòng)物、植物以及微生物機(jī)體防御體系的關(guān)鍵酶之一，機(jī)體的內(nèi)外環(huán)境變化可引起細(xì)胞代謝產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫是強(qiáng)氧化劑，對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，過氧化氫酶的存在可以及時(shí)清除細(xì)胞產(chǎn)生的過氧化氫，保護(hù)細(xì)胞免受過氧化物的毒害而應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。試驗(yàn)通過測(cè)定經(jīng)不同濃度甲苯咪唑浸泡的黃河鯉鰓組織、肝胰臟、腎臟中的CAT活性，探索了黃河鯉抗氧化防御體系對(duì)甲苯咪唑引起毒性效應(yīng)的應(yīng)答特性，以期了解黃河鯉對(duì)甲苯咪唑的抗毒機(jī)理，為黃河鯉集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)和水質(zhì)的評(píng)價(jià)、檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動(dòng)物

試驗(yàn)使用的黃河鯉來源于鄭州市漁場(chǎng)，其體重為40.4 g±1.86 g，體長(zhǎng)12 cm±2 cm。先將經(jīng)曝氣處理后的自來水注入水族箱中，隨后把黃河鯉置于水族箱中養(yǎng)殖，試驗(yàn)期間不投食。水質(zhì)條件如下：pH 6.8～7.4，溶氧6～10 mg/L，水溫13～15 ℃，總硬度為715（德國(guó)硬度），其他指標(biāo)符合文獻(xiàn)[6]的要求。

1.2 儀器與試劑

儀器主要有752紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、Anke TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、FA1604N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；玻璃勻漿器、1 cm石英比色皿、秒表、注射器（5 mL）以及解剖工具（各種類型鑷子、剪子和不銹鋼手術(shù)刀）。試劑主要有甲苯咪唑（廣東利建制藥有限公司）；甲酸（上海試劑一廠）； CAT試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與采樣

根據(jù)課題組已經(jīng)發(fā)表的甲苯咪唑?qū)S河鯉魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果[1]，設(shè)定1個(gè)空白對(duì)照組和4個(gè)染毒處理組，甲苯咪唑液的制備是將0.10 g甲苯咪唑溶于1 mL甲酸，然后用去離子水稀釋至試驗(yàn)所用甲苯咪唑濃度，分別為0.10、0.20、0.40、0.60 mg/L，每組3個(gè)水族箱，每箱放黃河鯉15尾，試驗(yàn)采用水質(zhì)接觸染毒法，試驗(yàn)期間不更換試液。

在含有不同濃度甲苯咪唑稀釋液水體的水族箱中，黃河鯉分別浸泡24、72、120、168 h后，從每箱中隨機(jī)選取3尾，迅速解剖，剪取鰓、肝胰臟和腎，用預(yù)冷的去離子水沖洗干凈，濾紙吸干后裝袋密封，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理

各組織樣品在4 ℃下解凍，迅速剪碎，按1∶9加入預(yù)冷生理鹽水（0.67%），玻璃勻漿管中勻漿5 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，再用生理鹽水稀釋成1%的組織勻漿液。

1.5 CAT活性測(cè)定

樣品的組織蛋白和CAT 活性的測(cè)定均采用南京建成生物科技有限公司試劑盒測(cè)定。CAT活性定義為：每毫克組織蛋白酶分解1 μmol H2O2的量為1個(gè)酶活性單位。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010程序處理，并用其制圖；運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，描述性統(tǒng)計(jì)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，以0.05為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水平，通過單因素方差分析進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲苯咪唑?qū)S河鯉鰓組織CAT活性的影響

甲苯咪唑?qū)S河鯉鰓組織CAT活性的影響情況見圖1。由圖1可知，各染毒處理組的鰓組織CAT活性都高于對(duì)照組，并且隨著甲苯咪唑濃度的升高，鰓組織CAT活性呈現(xiàn)出先增大后減少的變化趨勢(shì)，當(dāng)濃度為0.20 mg/L時(shí)達(dá)到最大。用這個(gè)濃度處理24、72、120、168 h后，與對(duì)照組相比，鰓組織CAT活性分別提高了5.18%、5.54%、4.19%、3.81%，其中72 h后大大高于對(duì)照組，24、120 h后明顯高于對(duì)照組，而168 h后與對(duì)照組相比，鰓組織CAT活性無明顯變化。隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組鰓組織CAT活性也呈現(xiàn)出先增大后減少的變化趨勢(shì)，且染毒時(shí)間為72 h時(shí)達(dá)到最大。與對(duì)照組相比，4個(gè)染毒處理組在72 h時(shí)鰓組織CAT活性分別提高了4.73%、4.53%、4.53%、2.10%，其中0.10、0.20 mg/L染毒處理組大大高于對(duì)照組，0.40 mg/L染毒處理組明顯高于對(duì)照組，而0.60 mg/L染毒處理組與對(duì)照組相比，鰓組織CAT活性無明顯變化。endprint

2.2 甲苯咪唑?qū)S河鯉肝胰臟CAT活性的影響

甲苯咪唑?qū)S河鯉肝胰臟CAT活性的影響情況見圖2。由圖2可知，暴露于不同濃度甲苯咪唑水體中的黃河鯉肝胰臟CAT活性變化規(guī)律與鰓組織CAT活性變化規(guī)律相似，CAT活性也是呈現(xiàn)出先增大后減少的變化趨勢(shì)，其中24 h后0.20 mg/L染毒處理組和72 h后各染毒濃度處理組CAT活性與對(duì)照組相比，均大大提高，分別提高了4.21%、6.53%、6.60%、6.88%、5.68%；24 h后0.10、0.40 mg/L染毒處理組和120 h后0.20 mg/L染毒處理組CAT活性與對(duì)照組相比，均明顯提高，分別提高了3.49%、5.26%、3.36%，而其他各染毒處理黃河鯉肝胰臟CAT活性與對(duì)照組相比均無明顯變化。

2.3 甲苯咪唑?qū)S河鯉腎臟CAT活性的影響

甲苯咪唑?qū)S河鯉腎臟CAT活性的影響情況見圖3，由圖3可知，暴露于不同濃度甲苯咪唑水體中的黃河鯉腎臟CAT活性變化規(guī)律與肝胰臟CAT活性變化規(guī)律相似，CAT活性也是呈現(xiàn)出先增大后減少的變化趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，24 h后0.20、0.40、0.60 mg/L染毒處理組和72 h后各染毒處理組黃河鯉腎臟CAT活性均大大提高，分別提高了6.78%、7.42%、6.78%、7.81%、8.66%、8.87%、7.95%，24 h后0.10 mg/L和120 h后0.20 mg/L染毒處理組黃河鯉腎臟CAT活性呈明顯提高，分別提高了5.58%、4.28%，而其他各染毒處理黃河鯉腎臟CAT活性與對(duì)照組相比均無明顯變化。

3 小結(jié)與討論

魚類對(duì)水體中的毒物較為敏感，鰓組織是魚體吸收毒物的主要部位，肝胰臟和腎臟是魚體吸收毒物后的主要解毒和排毒器官，因此通過研究毒物接觸后魚鰓、肝胰臟、腎臟中酶活性的變化，可以指示水體的毒物污染程度，并可預(yù)測(cè)毒物對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響。CAT是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，其功能是催化細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫分解，防止膜脂過氧化的發(fā)生，其中最主要的就是參與活性氧代謝過程。在環(huán)境脅迫等逆境情況下，生物體內(nèi)廣泛存在活性氧爆發(fā)現(xiàn)象，導(dǎo)致自由基增多，使細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化，細(xì)胞膜被破壞和損傷。在活性氧代謝過程中，CAT可以使H2O2發(fā)生歧化生成水和氧分子，與SOD、POD共同組成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，在清除超氧自由基、H202和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮著重要的作用[7]。賈秀英等[8]、成嘉等[9]分別研究了水中鎘離子和鉛離子等重金屬對(duì)水生動(dòng)物組織CAT活性的影響，徐境波等[10]、陳家長(zhǎng)等[11]、羅朝軍等[12]、黎東怡等[13]分別研究了硝基芳烴、除草劑阿特拉津、農(nóng)藥三唑磷、重鉻酸鉀等有機(jī)化合物對(duì)不同魚類組織CAT活性的影響，結(jié)果表明，隨重金屬離子、有機(jī)物濃度、接觸時(shí)間的不同，CAT活性呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)，對(duì)不同水生動(dòng)物CAT活性表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用，且隨時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的升高呈先升高、后降低的變化趨勢(shì)。本試驗(yàn)同樣表明甲苯咪唑?qū)S河鯉CAT活性具有明顯的誘導(dǎo)作用，呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)，且隨濃度的升高和時(shí)間延長(zhǎng)，CAT活性呈先升高、后降低的變化趨勢(shì)，特別是在染毒甲苯咪唑72 h后，各染毒處理濃度對(duì)黃河鯉的鰓、肝胰臟和腎臟CAT活性影響均達(dá)到較高水平，表明甲苯咪唑在一定的濃度范圍內(nèi)，對(duì)黃河鯉具有一定的生理調(diào)節(jié)機(jī)能；黃河鯉CAT活性對(duì)有毒物質(zhì)脅迫的敏感性，可以作為水生生態(tài)系統(tǒng)中有毒物質(zhì)的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，處理組隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)，黃河鯉3種組織器官中CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，這表明在一定濃度范圍內(nèi)，短時(shí)間內(nèi)甲苯咪唑?qū)S河鯉組織中CAT活性有一定的誘導(dǎo)作用，這可能是黃河鯉中毒的先兆；但隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT活性又出現(xiàn)一定程度的降低，可能是甲苯咪唑的毒性作用在加強(qiáng)，因此，CAT活性可作為甲苯咪唑中毒指示指標(biāo)；同時(shí)也表明甲苯咪唑引起黃河鯉中毒的主要靶分子可能就是CAT。

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