玉米ZmGLDH基因的克隆與表達(dá)分析

朱素琴，馬 紅，田 洋，尹文娟，許浣文，周 毅，楊 平

(1.南通大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226019； 2.南通大學(xué)/農(nóng)業(yè)部南方平原玉米科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，江蘇 南通 226019)

L-半乳糖途徑是植物合成AsA的主要途徑[4]，其過程簡示如下：D-葡萄糖→D-甘露糖-1-P→GDP-D-甘露糖→GDP-L-半乳糖→L-半乳糖-1-P→L-半乳糖→ L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯→ L-抗壞血酸。此途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶是L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase,GLDH)，該酶催化L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯產(chǎn)生AsA。GLDH在植物體中以單體形態(tài)存在，對L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯有很高的特異性，定位于線粒體內(nèi)膜[5]。在轉(zhuǎn)反義GLDH基因的煙草中，AsA含量很低。GLDH基因的表達(dá)受光誘導(dǎo)，并調(diào)節(jié)植物體中的AsA含量[6]。

玉米(ZeamaysL.)是全球種植面積最大的糧食作物之一，中國是世界上第二大玉米生產(chǎn)國。玉米在生長發(fā)育過程中，不可避免地會遭遇干旱、高鹽、低溫等極端生長環(huán)境，這些非生物脅迫因素嚴(yán)重影響了玉米的生長發(fā)育，導(dǎo)致減產(chǎn)，甚至顆粒無收。玉米GLDH是玉米AsA合成途徑中的關(guān)鍵酶，影響玉米AsA含量，進(jìn)而影響玉米細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，最終影響玉米的抗逆能力。玉米基因組中有1個(gè)GLDH基因(LOC 100381436)，有關(guān)ZmGLDH基因在玉米生長發(fā)育，特別是在干旱、高鹽逆境中的作用尚未見報(bào)道，鑒于此，根據(jù)MaizeGDB(http://www.maizesequence.org) 提供的序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到玉米ZmGLDH基因，同時(shí)研究了鹽脅迫對ZmGLDH基因表達(dá)的影響，分析了鹽脅迫處理后玉米葉片中AsA含量的變化，為進(jìn)一步研究該基因在玉米生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以大面積種植的鄭單958為試驗(yàn)材料。將種子暴曬1 d后，選取健壯飽滿的種子，用多菌靈浸泡1 h，去離子水充分漂洗后浸泡20 h，再將玉米種子均勻排列在墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100粒種子，于黑暗條件下30 ℃催芽，待胚根長至2～3 cm時(shí)，挑選長勢良好的發(fā)芽種子置于霍格蘭營養(yǎng)液中進(jìn)行溶液培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為30 ℃/25 ℃(晝/夜)，相對濕度為65%～70%，光子通量密度(photon flux density,PFD)為600 μmol/(m2·s)，培養(yǎng)玉米幼苗至三葉期。

將三葉期的玉米置于含有200 mmol/L NaCl的霍格蘭培養(yǎng)液中進(jìn)行處理，分別于處理后0(對照，CK)、0.5、1、2、3、4 h取材，進(jìn)行AsA含量測定和ZmGLDH基因表達(dá)分析。

1.2 菌株、載體及生化試劑

大腸桿菌菌株為DH5α，由南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，限制性內(nèi)切酶、卡那霉素(Kanamycin)購自TaKaRa公司，KOD-Plus-Ver.2、pTA2 載體、ReverTra Ace qPCR RT Kit購自TOYOBO公司，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┒⑸锛夹g(shù)有限公司，Trans DNA Marker Ⅳ、Trans Blue Plus protein Marker購自全式金生物技術(shù)公司。PCR引物合成、DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。克隆ZmGLDH基因所用引物序列為F：5′-TGCCGTCGCCGTCCATC-3′；R：5′-CCAGGGTAGGGTCCCAGAATC-3′。

1.3 ZmGLDH基因的克隆

根據(jù)玉米ZmGLDH基因序列(LOC 100381436)設(shè)計(jì)引物，以鄭單958為試驗(yàn)材料，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增ZmGLDH基因。PCR產(chǎn)物連接 pTA2 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，進(jìn)行菌落PCR篩選。挑取陽性菌落于含Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用TOYOBO公司的SYBR Green RT-PCR One Step Kit及ABI 7500 Real time PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測，Zmβ-actin作為內(nèi)參基因。ZmGLDH基因熒光定量PCR引物序列為：5′-GTCCATTCGGGAGCAGCAGGT-3′/5′-CCAAGTCCACAGCGAGCAAGATA-3′，Zmβ-actin內(nèi)參基因的引物序列為：5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′/5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。按相對定量法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量Rel.Exp=2-△△Ct，其中，△△Ct=(待測樣品目的基因的Ct-待測樣品內(nèi)參基因的Ct)-(對照樣品目的基因的Ct-對照樣品內(nèi)參基因的Ct)[7]。

1.5 AsA提取與含量測定

AsA的提取與含量測定按照張志良等[8]方法。AsA可以把鐵離子還原成亞鐵離子，亞鐵離子與紅菲咯啉(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP)反應(yīng)，形成紅色螯合物，在534 nm波長下有最大吸收峰，用比色法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmGLDH基因的克隆

2.1.1 玉米總RNA的提取 采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini試劑盒提取玉米葉片總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA。從圖1可以看到清晰的2條帶，分別是28S、18S的電泳條帶，28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，說明提取的RNA比較完整。同時(shí)，用分光光度計(jì)測定了所提RNA的濃度和純度，6個(gè)樣本RNA的OD260/OD280值均在1.9～2.0，表明所提RNA質(zhì)量符合克隆和熒光定量PCR的試驗(yàn)要求。

泳道1、2、3、4、5、6分別表示三葉期玉米在經(jīng)過200 mmol/L NaCl處理0、0.5、1、2、3、4 h后所提取到的葉片RNA圖1 玉米葉片RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.1.2ZmGLDH基因的克隆與GLDH分子結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)ZmGLDH基因序列(LOC 100381436)設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增ZmGLDH基因cDNA片段，克隆全長ZmGLDH基因，重組質(zhì)粒pTA2-ZmGLDH的酶切鑒定結(jié)果見圖2。陽性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果比對分析顯示，所測序列與MaizeGDB提供的序列一致。經(jīng)GSDS在線軟件分析，ZmGLDH基因有6個(gè)外顯子、5個(gè)內(nèi)含子，其全長cDNA序列包含一個(gè)1 761 bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF)，編碼586個(gè)氨基酸。

M.分子質(zhì)量標(biāo)記Trans 5k plus;1.EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒pTA2-ZmGLDH圖2 重組質(zhì)粒pTA2-ZmGLDH的酶切鑒定結(jié)果

蛋白質(zhì)氨基酸序列比對結(jié)果(圖3)顯示，玉米ZmGLDH(NP_001167748.1)與水稻OsGLDH(XP_015616655.1、XP_015619621.1)、高粱GLDH(XP_021317136.1)、谷子GLDH(XP_004977506.1)、擬南芥GLDH(NP_190376.1)的相似性分別為86%、86%、94%、94%、74%。根據(jù)UniProtKB/Swiss-Prot提供的分析結(jié)果，玉米ZmGLDH基因產(chǎn)物含586個(gè)氨基酸殘基，第1—39位氨基酸肽段是轉(zhuǎn)運(yùn)肽，第40—81位氨基酸肽段是被去除的肽段，GLDH酶蛋白含有505個(gè)氨基酸殘基(82—586位)。

TMpred-Prediction of Transmembrane Regions and Orientation預(yù)測ZmGLDH酶蛋白有3個(gè)跨膜肽段(圖4)：第132—154位氨基酸(23個(gè)氨基酸)為第1個(gè)跨膜肽段，第245—267位氨基酸(23個(gè)氨基酸)為第2個(gè)跨膜肽段，第472—496位氨基酸(25個(gè)氨基酸)為第3個(gè)跨膜肽段。ZmGLDH酶蛋白的N-末端位于線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)、C-末端位于內(nèi)膜外側(cè)。第1個(gè)和第3個(gè)跨膜肽段由線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)朝向線粒體內(nèi)膜外側(cè)，第2個(gè)跨膜肽段由線粒體內(nèi)膜外側(cè)朝向線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)。Conserved domain search預(yù)測ZmGLDH酶蛋白分子中第104—239位氨基酸(136個(gè)氨基酸)的肽段是結(jié)合FAD的結(jié)構(gòu)域(圖4中雙線表示)。結(jié)構(gòu)域中有28個(gè)氨基酸(第104—131位氨基酸)位于內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，23個(gè)氨基酸(第1個(gè)肽段，第132—154位氨基酸)橫跨內(nèi)膜，85個(gè)氨基酸(第155—239位氨基酸)位于內(nèi)膜的外側(cè)，因此，ZmGLDH酶蛋白結(jié)合FAD結(jié)構(gòu)域主要位于內(nèi)膜的外側(cè)[9-10]，所以ZmGLDH酶蛋白是位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)的膜結(jié)合酶。GLDH催化底物L(fēng)-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫生成AsA，同時(shí)，將高鐵細(xì)胞色素C(Ferricytochrome C，氧化型)還原為亞鐵細(xì)胞色素C(Ferrocytochrome C，還原型)。細(xì)胞色素C是呼吸鏈中介于復(fù)合體Ⅲ和復(fù)合體Ⅳ間且位于內(nèi)膜外側(cè)的重要電子傳遞體[11]。因此，AsA的從頭合成途徑與呼吸鏈的電子傳遞密切相關(guān)。

NP_001167748.1、XP_021317136.1、XP_004977506.1、NP_190376.1分別為玉米、高粱、谷子、擬南芥GLDH氨基酸序列登錄號，XP_015616655.1、XP_015619621.1為水稻GLDH氨基酸序列登錄號；氨基端灰色底紋大寫字母：轉(zhuǎn)運(yùn)肽；帶方框的字母：被去除的肽段；灰色底紋小寫字母：跨膜肽段(跨膜方向和相關(guān)肽段由Tmpred-Prediction of Transmembrane Regions and Orientation預(yù)測)；有下劃線的字母：結(jié)合FAD的結(jié)構(gòu)域

圖4 ZmGLDH與線粒體內(nèi)膜的結(jié)合

2.2 鹽脅迫下ZmGLDH基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

2.2.1 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線 分別提取對照及200 mmol/L NaCl處理0.5、1、2、3、4 h的玉米葉片總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。圖5中2組曲線分別是幾個(gè)樣品中ZmGLDH基因和內(nèi)參Zmβ-actin基因的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。從圖5可以看出，ZmGLDH基因和內(nèi)參Zmβ-actin基因的擴(kuò)增曲線基線穩(wěn)定，拐點(diǎn)清楚，各擴(kuò)增曲線平行性好，曲線指數(shù)期斜率比較大。圖6是ZmGLDH基因和內(nèi)參Zmβ-actin基因的熔解曲線。對PCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈逐漸解開，導(dǎo)致熒光信號強(qiáng)度逐漸下降，到達(dá)某一溫度時(shí)，會導(dǎo)致大量的PCR產(chǎn)物解鏈，熒光信號值急劇下降。不同PCR產(chǎn)物其Tm值不同，因此，使其熒光信號發(fā)生迅速下降的溫度也不同，據(jù)此可對PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定。用PCR產(chǎn)物熔解過程中熒光信號值的負(fù)一次導(dǎo)數(shù)對溫度作圖，得到單一熔解峰，說明擴(kuò)增的特異性較好。

圖5 ZmGLDH基因及內(nèi)參基因Zmβ-actin的擴(kuò)增曲線

圖6 ZmGLDH基因及內(nèi)參基因Zmβ-actin的熔解曲線

2.2.2 鹽脅迫對ZmGLDH基因表達(dá)的影響 根據(jù)ZmGLDH基因序列(LOC 100381436)，利用NCBI-Primer軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。采用熒光染料法在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR檢測，Zmβ-actin看家基因作為內(nèi)參標(biāo)化玉米cDNA的量。從圖7可以看出，經(jīng)過高鹽脅迫處理后，ZmGLDH基因的表達(dá)量上調(diào)。鹽脅迫處理0.5 h，ZmGLDH基因的表達(dá)量略有增加，為對照的1.07倍；鹽脅迫處理1 h，ZmGLDH基因的表達(dá)量繼續(xù)增加，但上升幅度較小，為正常條件下的1.20倍；鹽脅迫處理2 h，ZmGLDH基因表達(dá)量明顯增加，為正常條件下的2.31倍，達(dá)到最高表達(dá)水平；鹽脅迫處理3 h，ZmGLDH基因表達(dá)量略有下降，但仍高于對照組，為正常條件下的2.20倍；鹽處理4 h，ZmGLDH基因表達(dá)量繼續(xù)下降，為正常條件下的1.46倍。

圖7 鹽脅迫下玉米葉片中ZmGLDH基因的表達(dá)量變化

2.3 鹽脅迫對玉米葉片中AsA含量的影響

2.3.1 AsA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以不同質(zhì)量濃度AsA的OD534值對其相應(yīng)濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)。曲線回歸方程為y=0.251 7x+0.104 7，y表示AsA溶液在534 nm處的吸光度值，x表示溶液中AsA的質(zhì)量濃度(mg/L)。如圖8所示，AsA標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性很好，R2=0.993 9。

2.3.2 鹽脅迫下玉米葉片中AsA含量的變化 如圖9所示，鹽脅迫處理后，玉米葉片中AsA含量發(fā)生變化。在鹽脅迫處理1 h內(nèi)，玉米葉片中AsA的含量變化不明顯，隨著鹽處理時(shí)間的延長，玉米葉片中AsA含量增加。在正常條件下，玉米葉內(nèi)AsA含量為0.762 8 mg/g；鹽處理2 h，玉米葉內(nèi)AsA含量為1.481 7 mg/g，是對照的1.94倍；鹽處理 3 h，玉米葉內(nèi)AsA含量為1.781 7 mg/g，是對照的2.33倍；隨著鹽處理時(shí)間進(jìn)一步延長，玉米葉中AsA含量降低，鹽處理 4 h，玉米葉內(nèi)AsA含量為0.765 7 mg/g，與對照基本相同。

圖8 AsA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖9 鹽脅迫下玉米葉片中AsA含量的變化

2.4 玉米葉片中AsA含量與ZmGLDH基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

比較圖7與圖9可以看出，鹽脅迫處理后玉米葉片中AsA含量的變化趨勢與玉米葉內(nèi)ZmGLDH基因的表達(dá)量變化趨勢基本一致，即在鹽處理初期ZmGLDH基因的表達(dá)量和AsA含量的變化均不明顯；鹽脅迫處理2 h，ZmGLDH基因表達(dá)量達(dá)到最大，玉米葉內(nèi)AsA含量也明顯增加；鹽脅迫處理3 h，ZmGLDH基因表達(dá)量仍然很高，其葉內(nèi)AsA含量也達(dá)到最大。進(jìn)一步對ZmGLDH基因表達(dá)量與玉米葉內(nèi)AsA含量進(jìn)行回歸分析(圖10)，結(jié)果顯示，ZmGLDH基因表達(dá)量與玉米葉內(nèi)AsA含量呈正相關(guān)關(guān)系，R2=0.822 8，說明鹽脅迫下玉米葉片細(xì)胞內(nèi)ZmGLDH基因的表達(dá)水平是影響葉內(nèi)AsA含量的主要因素。

圖10 鹽脅迫下玉米ZmGLDH基因表達(dá)量與葉內(nèi)AsA含量的回歸分析

3 結(jié)論與討論

L-半乳糖途徑被公認(rèn)為是高等植物中合成AsA的主要途徑，該途徑的最后一步由GLDH催化L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成L-抗壞血酸，是AsA合成的關(guān)鍵步驟。GLDH定位于線粒體內(nèi)膜上，需要氧化態(tài)的細(xì)胞色素C(Cytochrome C，CytC)作為電子受體，CytC被還原，再把電子傳遞給復(fù)合體Ⅳ[11]。因此，AsA的從頭合成與呼吸鏈電子傳遞狀況有關(guān)。很多研究表明，GLDH基因的表達(dá)水平與植物體內(nèi)的AsA含量密切相關(guān)[16-19]。本研究以玉米為材料，克隆了玉米GLDH基因，研究了ZmGLDH基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)特性，測定了鹽脅迫下玉米葉片中AsA含量的變化，結(jié)果表明，ZmGLDH基因在鹽脅迫條件下表達(dá)量的變化趨勢與玉米葉片中AsA含量的變化趨勢基本一致。GLDH在植物AsA的生物合成途徑中所起的關(guān)鍵作用越來越受到研究者的重視，有關(guān)GLDH的生物化學(xué)特性、酶學(xué)特征、分子生物學(xué)特性、功能等方面的研究，也受到了業(yè)界的高度關(guān)注，并取得了一定的進(jìn)展[20-21]。相信隨著研究的不斷深入，人們可以通過調(diào)控GLDH基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對植物AsA生物合成的調(diào)控，為提高植物AsA含量并提高植物的抗逆能力提供一條有效途徑。

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