共水蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油及其成分分析

李建軍，任美玲，尚星晨，連笑雅,王紅磊

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.河南綠生堂金銀花生物發(fā)展股份有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453007)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花，是常用大宗中藥材，具有很好的涼散風(fēng)熱、殺菌消炎等功效[1-2]。揮發(fā)油是一類植物源次生代謝物質(zhì)，分子量小且可隨水蒸氣蒸出，為具有一定揮發(fā)性的油狀液體物質(zhì)，植物學(xué)上稱為精油，商業(yè)上稱芳香油，化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)上稱揮發(fā)油[3]。金銀花揮發(fā)油不僅具有濃烈的芳香氣味，還有清咽、解熱、化痰、平喘等功效[4]，常用于醫(yī)藥、化妝、香料、食品等工業(yè)[5]。

河南省作為金銀花的道地主產(chǎn)區(qū)[6]，具有豐富的金銀花資源和種植炮制技術(shù)。河南道地產(chǎn)區(qū)封丘，具有獨(dú)特的生態(tài)條件和地理條件[7]，十分適宜金銀花生長?？墒且蛏罴庸きh(huán)節(jié)薄弱，制約了金銀花種植產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，深入開展金銀花深加工[8-10]，延伸產(chǎn)業(yè)鏈條，不僅可以促進(jìn)金銀花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)與社會效益，還能提升河南金銀花產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。

本研究采用共水蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油，通過單因素試驗(yàn)，考查了金銀花粉碎度、料液比、浸泡時間和提取時間對金銀花揮發(fā)油得率的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝，并對所得揮發(fā)油進(jìn)行了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(GC-MS)，優(yōu)化了檢測條件，為工業(yè)化提取金銀花揮發(fā)油提供理論技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

金銀花花蕾(大毛花，購于河南封丘金銀花種植專業(yè)合作社),無水硫酸鈉、乙醚均為分析純,去離子水(實(shí)驗(yàn)室自制)等。

1.2 儀器設(shè)備

ZNHW恒溫電加熱套(上海恬恒儀器有限公司)；Agilent 6890/5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：Agilent 7683型自動進(jìn)樣器、Nist 98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫(美國Agilent 公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 共水蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 金銀花粉碎度對得率的影響 取250 g不同粉碎度的金銀花樣品，置于5 L圓底燒瓶中，加入2 500 mL 5%氯化鈉[11]，連接揮發(fā)油測定器，在測定器中加去離子水至溢流入燒瓶為止，加熱溶液至沸騰，提取時間8 h，測定所得揮發(fā)油質(zhì)量。比較不同金銀花粉碎度下金銀花揮發(fā)油的得率。

1.3.1.2 浸泡時間對得率的影響 取250 g粉碎度0.85 mm的金銀花樣品，置于5 L圓底燒瓶中，加入2 500 mL 5%氯化鈉浸泡不同時間，其他步驟同1.3.1.1。比較不同浸泡時間下金銀花揮發(fā)油的得率。

1.3.1.3 料液比對得率的影響 取250 g粉碎度0.85 mm的金銀花樣品，置于5 L圓底燒瓶中，以不同料液比加入5%氯化鈉，其他步驟同1.3.1.1。比較不同料液比下金銀花揮發(fā)油的得率。

1.3.1.4 提取時間對得率的影響 取250 g粉碎度0.85 mm的金銀花樣品，置于5 L圓底燒瓶中，加入2 500 mL 5%氯化鈉，連接揮發(fā)油測定器，在測定器中加去離子水至溢流入燒瓶為止，加熱溶液至沸騰，提取不同時間，測定所得揮發(fā)油質(zhì)量。比較不同提取時間下金銀花揮發(fā)油的得率。

1.3.2 正交試驗(yàn) 選擇粉碎度、提取時間、浸泡時間和料液比作為正交試驗(yàn)的研究因素，在單因素最佳試驗(yàn)參數(shù)上下選取3個參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表1。

1.3.3 金銀花揮發(fā)油GC-MS分析 取揮發(fā)油產(chǎn)物適量，溶于乙醚溶液中，再加入適量無水硫酸鈉進(jìn)行脫水處理，過0.45 μm濾膜，樣品質(zhì)量濃度8 g/L。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

色譜條件：色譜柱HP-5MS 5%Phenyl MethylSiloxane Capillary 30.0 m×250 μm×0.25 μm nominal；載氣為高純氦氣(He)；流速0.6 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量為1.0 μL；柱溫：程序升溫，初始溫度 80 ℃，升溫速率為8 ℃/min升至120 ℃，保留20 min，5 ℃/min升至250 ℃，保留25 min。

質(zhì)譜條件：進(jìn)樣口溫度200 ℃，輔助線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃。 四級桿160 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV，電子倍增管電壓1.89 kV；掃描質(zhì)量范圍15.00～550.00 amu；采用Nist 98標(biāo)準(zhǔn)譜庫對采集到的各個成分質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花揮發(fā)油提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 金銀花粉碎度對得率的影響 由圖1可知，揮發(fā)油得率隨著金銀花粉碎度的升高而增加。當(dāng)金銀花粉碎度大于0.25 mm時，在加熱過程中溶液易出現(xiàn)糊底現(xiàn)象，不利于試驗(yàn)進(jìn)行。前人研究表明，粉末太細(xì)時，提取揮發(fā)油得率很低甚至沒有，切斷處理后的金銀花采用共水蒸餾法提取出的金銀花揮發(fā)油質(zhì)量更高[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，粉碎0.85 mm處理比切斷2～3 mm處理揮發(fā)油質(zhì)量高很多。因此，在試驗(yàn)中或生產(chǎn)中不適宜使用太細(xì)的粉末，金銀花最佳粉碎度為粗粉，直徑0.85 mm。

圖1 金銀花不同粉碎度的揮發(fā)油得率

2.1.2 浸泡時間對得率的影響 由圖2可知，浸泡時間較短時對得率影響不明顯，可能因?yàn)榧訜釙r間較長，浸泡時間對提取率的影響可以忽略不計，在后期延長浸泡時間后，揮發(fā)油得率有明顯提高，加水浸泡能使細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞膨脹，加速細(xì)胞內(nèi)外液動態(tài)交換，利于揮發(fā)油的浸出[13]。浸泡24 h與浸泡36 h揮發(fā)油得率相當(dāng)，從節(jié)約時間成本考慮，在生產(chǎn)中可以采用浸泡24 h。

圖2 金銀花不同浸泡時間的揮發(fā)油得率

2.1.3 料液比對得率的影響 由圖3可知，揮發(fā)油得率隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比升至1∶12 (g∶mL，下同)時，得率反而下降，可能由于料液比的增加，揮發(fā)油在水中的溶解量增加[14]，使得隨水蒸氣蒸出的揮發(fā)油量減少，揮發(fā)油得率降低。綜合以上因素，確定料液比最佳為1∶10。

圖3 金銀花不同料液比的揮發(fā)油得率

2.1.4 提取時間對得率的影響 由圖4可知，揮發(fā)油得率隨著提取時間的增加而增加，提取40 h與46 h 差異不大，說明在本試驗(yàn)條件下，提取40 h時金銀花揮發(fā)油大約能夠提取完全，此時金銀花揮發(fā)油得率約為0.170%。

圖4 金銀花不同提取時間的揮發(fā)油得率

2.2 金銀花揮發(fā)油提取正交試驗(yàn)結(jié)果

按照表1進(jìn)行揮發(fā)油共水蒸餾提取正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，共水蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油中4個因素的影響順序?yàn)椋悍鬯槎?提取時間>浸泡時間>料液比。由直觀分析可知，最佳提取條件為A2B2C3D3，即粉碎度0.85 mm，料液比1∶10，浸泡時間28 h，提取時間42 h。

表2 共水蒸餾正交試驗(yàn)結(jié)果

以正交試驗(yàn)得到的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，取250 g 粉碎度0.85 mm的金銀花置于5 L圓底燒瓶中，加入2 500 mL 5%氯化鈉溶液，攪拌搖勻后，浸泡28 h，連續(xù)提取42 h，試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，得到金銀花揮發(fā)油的平均得率為0.171%，高于正交試驗(yàn)結(jié)果中的最高值，證明通過正交試驗(yàn)得到的優(yōu)化條件可信。確定最佳提取工藝為：粉碎度0.85 mm，料液比1∶10，浸泡時間28 h，提取時間42 h。

2.3 金銀花揮發(fā)油GC-MS分析

產(chǎn)物揮發(fā)油經(jīng)處理后進(jìn)行GC-MS分析，得到揮發(fā)油總離子流色譜(圖略)；對每個成分進(jìn)行Nist 98質(zhì)譜庫檢索，共鑒定出79種成分，外標(biāo)法計算各個物質(zhì)的峰面積，并對色譜圖中的各峰面積進(jìn)行歸一化，得到各組分的相對含量，結(jié)果見表3。

由表3可知，采用共水蒸餾提取的金銀花揮發(fā)油成分種類繁多，鑒定成分79種,其含量占總成分的99.14%，其中脂肪酸類成分9種，占69.10%，酯類成分18種，占18.15%，烷烴類成分15種，占5.33%，酮類成分6種，占1.89%，烯烴類成分7種，占0.81%，醛類成分7種，占0.58%，炔烴類成分2種，占0.36%，醇類成分6種，占1.38%，其他成分9種，占1.54%。含量較高的單體成分及其含量為：棕櫚酸占46.42%，亞油酸占14.32%，十六烷酸甲酯占6.02%，亞麻酸甲酯占4.45%，亞油酸甲酯占3.19%，十八烷酸占2.66%，二十七烷占1.87%，月桂酸占1.59%，鄰苯二甲酸二丁酯占1.32%，二十五烷占1.08%，十九烷占1.03%等，含量較高的單體成分大部分為脂肪酸、脂類和烷烴類物質(zhì)。

表3 金銀花揮發(fā)油成分的GC-MS分析

續(xù)表3 金銀花揮發(fā)油成分的GC-MS分析

注：21和22號物質(zhì)，在CAS庫中暫無相應(yīng)的中文名,21號物質(zhì)CAS號為019890-84-7,22號物質(zhì)CAS號為026184-88-3。

3 結(jié)論與討論

目前，生產(chǎn)上大多采用水蒸氣蒸餾法來提取藥材中的揮發(fā)油，該法可使揮發(fā)油的提取和藥材煎煮同時進(jìn)行，節(jié)約時間和能源[15]。水蒸氣蒸餾法可分為2種：共水蒸餾法，即把植物浸在水中再進(jìn)行加熱來產(chǎn)生水蒸氣；通水蒸氣蒸餾法，即直接把水蒸氣通入放有植物的容器中[11]。本研究采用共水蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油，以250 g金銀花為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最佳提取條件為金銀花粉碎度0.85 mm，5%氯化鈉溶液浸泡28 h，料液比1∶10，提取42 h，得率0.171%。

何文全等[16]以100 g粉碎金銀花為原料，通過正交試驗(yàn)得到共水蒸餾提取金銀花揮發(fā)油的最佳工藝為浸泡2 h，提取時間5 h，加水量8倍，得率0.056%。與何文全等[16]的結(jié)果相比，本研究提取時間較長，考慮與所用金銀花的量較大有關(guān)，本研究揮發(fā)油提取率較高，說明對金銀花粉碎度進(jìn)行優(yōu)化[11]和氯化鈉浸泡處理能夠提高揮發(fā)油得率。

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過提高檢測樣品質(zhì)量濃度(8 g/L)，減慢氣相色譜升溫速率(初始溫度 80 ℃，以8 ℃/min升至120 ℃，保留20 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保留25 min)，能夠優(yōu)化檢測條件，使揮發(fā)油出峰情況良好，在該色譜條件下，檢測到金銀花揮發(fā)油成分79種。狄留慶等[17]通過水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油被鑒定出成分27種，主要成分為有機(jī)酸類和有機(jī)酸脂類；宋興良等[18]通過共水蒸餾提取的揮發(fā)油鑒定物質(zhì)38種，主要成分為有機(jī)酸類、有機(jī)酸脂類和飽和烷烴類。本研究與前人鑒定的揮發(fā)油主要成分種類相同，檢出成分較多，在每個物質(zhì)種類下檢測得到的單體化合物種類豐富，并且檢測到其他種類化合物較多。說明本研究優(yōu)化的色譜條件良好，有利于分離揮發(fā)油中單體化合物。

本研究以封丘大毛花為試驗(yàn)材料，優(yōu)化共水蒸餾法提取工藝和揮發(fā)油檢測條件，提取率達(dá)0.171%，鑒定揮發(fā)油成分79種，可為工業(yè)化提取金銀花揮發(fā)油及其質(zhì)量控制提供技術(shù)理論支撐。

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