生物絮凝-羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)啟動階段絮體胞外聚合物、粗蛋白和總氨基酸變化

程麗妹， 陳家捷 ，高錦芳 ，羅國芝,2

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 2.上海水產養(yǎng)殖工程技術研究中心，上海 201306)

生物絮凝技術 (Bio-floc Technology，BFT)可以通過微生物作用，將養(yǎng)殖過程中產生的養(yǎng)殖固體廢棄物(殘餌、糞便等)轉化成部分養(yǎng)殖對象可攝食的絮體餌料，且對水體中氨氮等有顯著的去除效果。在凈化養(yǎng)殖水體水質的同時，還可實現餌料的循環(huán)利用，是緩解水產養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展所面臨的環(huán)境制約和資源重復利用的有效技術[1-3]。

養(yǎng)殖過程中，絮體的沉降性能對養(yǎng)殖對象有重要的影響。沉降性能不佳，使水質渾濁，影響池塘中藻類光合作用，減少水體中能量來源；沉降性能太好，則增加了系統(tǒng)的攪拌負荷，不利于絮體以及絮體中微生物的生長，所以沉降性能不佳或太好，均不利于養(yǎng)殖對象的生長。研究表明，生物絮體中總的EPS約占活性污泥總有機物質量的80%，是生物絮體的主要組成成分[4]，且對污泥沉降和絮凝性能具有重要影響，其主要由LB-EPS和TB-EPS兩部分組成[5]。Liao等[6]通過對大量數據統(tǒng)計分析發(fā)現，大量 EPS會使絮體的沉降性能變差。研究表明，EPS的成分有多糖、蛋白質、氨基酸、核酸、脂類、糖醛酸和腐殖質等，且以多糖[7]和蛋白質[8]為主，兩者總含量約占EPS總量的70%～80%[9]。研究表明，TB-EPS含量的增加可以促進生物絮凝，但當其含量超過60 mg/L，TB-EPS含量的增加對生物絮凝效果沒有明顯的影響[10]。王紅武等[5]指出LB-EPS對污泥的沉降性能以及絮凝性能起著主導作用，當LB-EPS含量越多時，污泥沉降和絮凝性能越差。在前人的諸多研究中，因不同研究中EPS來源不同，同時忽略了EPS內外層性能以及提取方法的差異，所以使得大家的研究結果存在較大差異，且關于EPS對絮體沉降性能的影響沒有定論。

本實驗對生物絮凝-新吉富羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)啟動階段生物絮體EPS、營養(yǎng)成分以及沉降性變化作了初步研究，以期為生物絮凝技術的深入應用提供理論技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及運行工況

實驗用新吉富羅非魚取自上海海洋大學水產養(yǎng)殖研發(fā)平臺，挑選體質健康，規(guī)格一致的個體進行實驗，實驗用魚的平均體重為58.30 g。實驗投喂飼料為膨化配合飼料，采購自漳州日高飼料有限公司。飼料的營養(yǎng)成分：水分10%，粗蛋白37.9%，粗纖維12.0%，粗灰分13.0%。實驗用碳源為一水葡萄糖(分析純)。

實驗在上海海洋大學循環(huán)水養(yǎng)殖研發(fā)平臺內進行。實驗設置在3個養(yǎng)殖有效容積為1 m3的養(yǎng)殖缸內進行，用1 kW可控溫加熱棒控制養(yǎng)殖水體溫度在25 ℃左右，每個養(yǎng)殖缸中投放9 192 g的新吉富羅非魚。每日投喂餌料2次，按魚體重3%的投喂量進行投喂。實驗期間通過電磁式空氣泵(ACO-008，138 W，浙江森森實業(yè)有限公司)向養(yǎng)殖缸內24 h無間斷充氣，使養(yǎng)殖水體中的溶氧維持在5 mg/L以上。以NaHCO3調節(jié)pH，控制pH值在7.0～8.5的范圍內，添加葡萄糖作為碳源，其添加量按文獻[5]中的公式：△CH=0.465x 餌料投喂量，即需要添加碳源量為投喂飼料質量的46.5%，同時調控碳氮比(C/N)維持在15以上；每3 d通過沉淀吸附過多的固體懸浮物來調節(jié)養(yǎng)殖缸內的總固體懸浮物(Total solid suspension,TSS)；每日觀察并記錄羅非魚狀況；實驗周期為31 d。

1.2 水質指標的測定

1.3 絮體指標的測定

每3 d從養(yǎng)殖缸中收集一定量的絮體，經65 ℃干燥后，使用元素分析儀測定C、N 含量。生物絮體內含N量濃度=TSS (mg/L)·N(%)，污泥沉降指數(SVI)：衡量絮體沉降性能重要指標，指混合液沉降5 min或30 min相應的1 g干絮體所占的體積即為SVI。每3 d用英霍夫錐形管測定30 min后的絮體體積(FV-30 min)，以FV-30 min與MLSS之比計算絮體體積指數(SVI30)；粗蛋白含量采用杜馬斯燃燒定氮法[13]；樣品經過普通水解后在氨基酸自動分析儀(S-433D，SykamGmbh，德國)上測定氨基酸的含量。

1.4 EPS提取方法及測定

取40 mL混合液，4 000g離心5 min，倒去上清液，取固體加入20 mL純水用漩渦振蕩器重懸浮1 min得到固體，將混合液用6 000g離心，得到上清液，經0.45 μm濾膜過濾所得濾液即為松散附著的胞外聚合物(LB-EPS)。將剩余固體用20 mL超純水重懸浮，得到混合液放置在冰水浴中用細胞破碎儀(SCIENTZ-ⅡD，寧波新芝，中國)400 W超聲波10 min，10 000g離心，上清液經0.45 μm濾膜過濾后所得濾液即為緊密粘附的胞外聚合物(TB-EPS)。EPS 中的多糖 (PS) 含量采用硫酸-蒽酮法測量 (標準物質為葡萄糖) ；蛋白質含量 (PN) 采用修正的Folin-酚法測量 (標準物質為牛血清蛋白 )；DNA含量采用二苯胺法進行測量(標準物質為2-脫氧-D-核糖)[14,15]，總有機碳(Total organic carbon,TOC)利用總有機碳分析儀測定(MultiN/C 2100，耶拿，德國),腐殖酸含量用修正的Folin-酚法測量。研究表明，生物絮體中總EPS的質量大概占活性污泥總有機物質量的80%左右，所以在生物絮體中EPS是其主要組成成分，故EPS的總量可以用TOC表示[15-17]。

2 結果與討論

2.1 養(yǎng)殖缸中水質變化

圖1 養(yǎng)殖缸中水質的變化(平均值±標準差)

2.2 絮體沉降性

本實驗中，如圖2(a)所示，在反應建立的前15 d，SVI30先升高，之后出現下降。說明生物絮體在形成過程中，SVI30先升高后降低，其沉降性能先降低后升高。結合圖4和圖5分析原因是：在實驗的前期，生物絮體中的LB-EPS含量較多，而在LB-EPS中以多糖為主，隨著反應的進行，LB-EPS的含量下降，TB-EPS的含量上升，導致LB-EPS占總EPS含量的百分數下降，使得TB-EPS發(fā)揮了主導作用，且在TB-EPS中以蛋白質為主。據報道[16]，對于不膨脹的污泥，SVI值直接與Zeta電位(或葡聚酸含量)成正比，即胞外多糖物質增加，污泥SVI值增加，沉降性能降低；另外LB-EPS位于絮體的外部，主要以離子鍵和氫鍵結合在一起，具有較高的表面負電荷與較強的結合水能力，使絮體外層具有較大靜電斥力與空間位阻，使得絮體的沉降性能變差[5,10,16]。所以污泥的沉降性能出現先降低后升高的現象。同時結合圖4和圖5知，在本實驗的整個實驗過程中SVI30的變化趨勢與LB-EPS中多糖的變化趨勢相似，而LB-EPS中以多糖為主，所以當LB-EPS發(fā)生變化時，SVI30也發(fā)生變化；到實驗后期LB-EPS在EPS的主導作用被TB-EPS逐漸取代，使得SVI30上升，絮體沉降性變好。同樣王紅武等[5]的實驗結果表明，LB-EPS含量與SVI兩者之間的關系成線性正相關，LB-EPS含量的降低，導致SVI下降，而SVI基本不受TB-EPS的影響，這與本實驗結果相似。而在馬興冠等[21]的研究表明，EPS總量、蛋白質及多糖與SVI的多項式非線性回歸方程均表現為正相關性，多糖、蛋白質含量增加，SVI 整體上均呈逐漸增大的趨勢，本實驗結果與其相比，存在一定出入，分析原因是其將胞外聚合物(EPS)當作整體來研究，沒有將其分為LB-EPS和TB-EPS兩部分分析。

有研究指出，在生物絮體中TB-EPS含量遠比LB-EPS高，且相較LB-EPS而言，TB-EPS對絮凝性影響更大[14]，因此生物絮體形成的關鍵是TB-EPS。TB-EPS在內層，通過疏水結合部位結合在一起，且TB-EPS含有較少的帶電官能團或極性基團，通過氫鍵或趨向力結合的水分子數目較少，大分子之間或大分子與細菌細胞之間的結合更加緊湊。另外，隨著污泥齡的增大，TB-EPS疏水性增大，所結合的水分子減少，導致絮體內部結構密實從而促進活性污泥沉降[5,10,22-23]。實驗過程中，SVI30在27.66 mL/g到74.96 mL/g范圍內，絮體未發(fā)生膨脹處于正常范圍。由圖2(b)知，隨著絮體的發(fā)展VSS不斷增加，說明絮體中生物量也在不斷的增加，生物絮凝系統(tǒng)啟動效果良好。

圖2 絮體的SVI30 (a)和VSS (b)變化(平均值±標準差)

2.3 生物絮體營養(yǎng)成分的變化

圖3是絮體中總氨基酸和粗蛋白含量的變化，從圖中可以看出隨著反應的進行，絮體中粗蛋白和總氨基酸的含量不斷增加，在第31天時，粗蛋白含量為37.55%與飼料中37.87%接近。在Grab[19]和Luo[19]等的研究中發(fā)現，絮體中粗蛋白的含量可以達到26.35%～28%，本實驗研究結果發(fā)現絮體中粗蛋白的含量相對較高。分析其原因，可能是由于在投餌過程中所投餌料過剩，導致系統(tǒng)中殘餌量較多所引起的。

圖3 絮體中粗蛋白和總氨基酸變化 (平均值±標準差)

2.4 EPS的變化

本實驗中絮體形成階段EPS變化如圖4和圖5。在經過31 d的反應后， TOC的總量呈下降趨勢，說明反應系統(tǒng)中EPS的含量在下降。由圖4(a)所示，在實驗初期LB-EPS中的蛋白質、腐殖酸、多糖和DNA等成分的含量在不同時期出現增長，基本從實驗第15天開始，均呈下降趨勢，從圖4(b)可以看出，在整個實驗過程中LB-EPS的總含量呈下降趨勢。由圖5(a)可知，在實驗的前15 d，TB-EPS中的蛋白質、腐殖酸、多糖和DNA等成分的含量均呈現上升趨勢，之后出現下降。對應圖5(b)，在實驗的前15 d，TB-EPS的含量呈現上升趨勢，15 d之后直到實驗結束，TB-EPS的含量均在下降。即在生物絮體形成階段LB-EPS的含量呈下降趨勢，而TB-EPS的含量呈現先升高后下降的變化趨勢。另外，由圖4(a)和圖5(a)分別可以看出，LB-EPS的成分以多糖為主，而TB-EPS的主要成分則是蛋白質。

EPS是微生物為了適應環(huán)境而分泌的高分子有機化合物，可將細菌、顆粒碎屑連接形成菌膠團[5,16]。Liu等[20,23-24]人的研究指出，水體中磷元素的增加會抑制EPS的產生。結合圖1(b)可知在整個實驗過程中，由于養(yǎng)殖系統(tǒng)中固體廢棄物的不斷積累，降解和分解，使得反應系統(tǒng)中總磷的含量一直增加，在一定程度上抑制了EPS的產生。研究表明，隨著污泥齡的增加，LB-EPS的含量被細菌作為碳源和能源物質不斷降解[25]，導致其含量下降。另外，開始時養(yǎng)殖缸內細菌呈對數增長，因此TB-EPS含量不斷增加，但在之后適應了環(huán)境，從而TB-EPS含量開始降低。本實驗均與前人研究結果相一致。

圖4 LB-EPS含量變化(平均值±標準差)

圖5 TB-EPS含量變化(平均值±標準差)

3 結論

原位式生物絮凝養(yǎng)殖新吉富羅非魚的啟動階段，控制養(yǎng)殖水體中溶氧5 mg/L，水溫25 ℃時，由于碳源的添加不足，養(yǎng)殖缸內硝態(tài)氮發(fā)生積累，由初始的3.85 mg/L增加到了第31天的77.08 mg/L。且整個實驗過程中，PO43--P一直在積累，從第21天開始下降并維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，而總磷的質量濃度一直處于增長的狀態(tài)。

在絮體形成過程中，SVI30先升高后降低，說明沉降性能先降低后升高。生物絮體的SVI30受LB-EPS影響較大，而TB-EPS的含量對生物絮體的SVI30沒有顯著的影響；即生物絮體的沉降性能先變差之后變好；且絮體中的生物量不斷增加。

隨著反應的進行，絮體中粗蛋白和總氨基酸的含量不斷增加，在第31天時粗蛋白含量達到37.55%，與飼料中37.87%相接近?？偘被岬暮恳恢北３种鲩L的趨勢，其變化趨勢基本與粗蛋白變化趨勢相似。

本實驗中，絮體形成階段EPS的含量總體呈下降趨勢；且EPS主要由LB-EPS和TB-EPS組成；而LB-EPS中其成分以多糖為主，且隨著絮體的發(fā)展LB-EPS呈下降趨勢；而TB-EPS的主要成分是蛋白質，其變化是隨著絮體的發(fā)展TB-TPS先升高后降低。

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