SDBS對(duì)大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育及幼魚(yú)性腺發(fā)育的影響

葉遼遼，徐 勝，袁秋蕓，陳平法，溫安祥

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625000)

十二烷基苯磺酸鈉(Sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS)是一種陰離子表面活性劑，易溶于水，具有強(qiáng)力去污、濕潤(rùn)、發(fā)泡等功能，被廣泛用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和日用化工等多種領(lǐng)域。雖有研究表明SDBS具有良好的生物降解性，但水體環(huán)境復(fù)雜多樣，SDBS的微生物降解受到環(huán)境因素的影響很大，因而仍有SDBS殘留[1,2]。譚渝云等[3]研究發(fā)現(xiàn)SDBS能通過(guò)鰓吸收或食物鏈富集于魚(yú)體。過(guò)量的表面活性劑釋放到環(huán)境中會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生眾多的負(fù)面影響，如腹瀉、消瘦、皮膚過(guò)敏、壞死以及呼吸問(wèn)題等[4]，且SDBS還可對(duì)雄性小鼠和果蠅的生育能力產(chǎn)生顯著影響[5-7]。因鰍類獨(dú)特的生物學(xué)特性和對(duì)某些污染物或藥物的敏感性而成為理想的實(shí)驗(yàn)材料[8-10]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)孵化實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分別考察不同濃度SDBS與大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)胚胎發(fā)育及幼魚(yú)性腺發(fā)育的關(guān)系，以期為進(jìn)一步探明SDBS對(duì)水生動(dòng)物的影響提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SDBS購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。參照于淑池等[11]的泥鰍毒性實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)了0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mg/L 6個(gè)SDBS濃度梯度進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定SDBS濃度梯度為0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L。大鱗副泥鰍親鰍(雄鰍2尾、雌鰍4尾)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物學(xué)實(shí)踐教學(xué)基地提供。用LRH-A2(寧波市三生藥業(yè)有限公司)和DOM(寧波第二激素廠)催產(chǎn)，獲取受精卵用于胚胎發(fā)育實(shí)驗(yàn)。70日齡大鱗副泥鰍購(gòu)于四川省眉山市“麥綠漁業(yè)有限公司”，用于幼魚(yú)性腺發(fā)育實(shí)驗(yàn)。

1.2 SDBS對(duì)大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育的影響

將受精卵隨機(jī)分成7組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 000粒，分組置于0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L SDBS溶液中充氧孵化。受精10 h后，每2 h觀察一次孵化情況，直至孵化結(jié)束。統(tǒng)計(jì)培育周期、孵化周期、孵化率和畸形率(培育周期[12]指同時(shí)受精的一批卵中從受精到50% 孵化出膜時(shí)所用的時(shí)間；孵化周期指同時(shí)受精的一批魚(yú)卵從第一尾仔魚(yú)孵出至最后一尾仔魚(yú)孵化出時(shí)間間隔；孵化率=成形的仔魚(yú)/受精卵數(shù)×100%；畸形率=畸形仔魚(yú)數(shù)/成形仔魚(yú)數(shù)×100%)。

1.3 SDBS對(duì)大鱗副泥鰍幼魚(yú)性腺發(fā)育的影響

參照史改花等[13]對(duì)大鱗副泥鰍性腺分化的研究，選取70日齡性腺分化完全,體重3 g左右的健康大鱗副泥鰍210尾，隨機(jī)分成7組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾(據(jù)大鱗副泥鰍胸鰭形狀判斷性別，雌雄各5尾)，分組置于0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L SDBS溶液中。根據(jù)SDBS降解速率[14]，每日全部更換一次玻璃魚(yú)缸中SDBS配制液。處理60 d后，統(tǒng)計(jì)各組大鱗副泥鰍的死亡情況，從每個(gè)濃度的各平行組中取雌雄鰍各3尾，制作性腺組織切片(5.0 mg/L濃度組死亡較多，將剩余大鱗副泥鰍全部制作切片)，H.E染色觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。采用概率單位法計(jì)算半致死濃度LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDBS處理后大鱗副泥鰍受精卵孵化情況

SDBS≤1.0 mg/L時(shí)，各濃度組大鱗副泥鰍受精卵的培育周期、孵化周期、孵化率和畸形率與對(duì)照組均無(wú)顯著差異。2.5 mg/L和5.0 mg/L濃度組的培育周期和孵化周期均顯著高于對(duì)照組，孵化率分別為69.18%和12.02%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組94.46%；鰍苗畸形率分別為4.23%和7.62%，是對(duì)照組的3～5倍，且2.5 mg/L與5.0 mg/L SDBS組之間大鱗副泥鰍的孵化率和鰍苗畸形率也存在顯著差異。此外，5.0 mg/L SDBS中部分受精卵有明顯的破裂現(xiàn)象。根據(jù)概率單位法計(jì)算，SDBS對(duì)大鱗副泥鰍受精卵的半致死濃度2d-LC50為2.935 mg/L。

表1 不同濃度SDBS對(duì)大鱗副泥鰍受精卵孵化的影響

注：使用LSD方法進(jìn)行單因素方差分析，同列數(shù)據(jù)右肩標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 SDBS處理60 d大鱗副泥鰍的死亡情況

0.3、0.5、1.0、2.5 mg/L SDBS組中大鱗副泥鰍相繼出現(xiàn)不同程度的細(xì)菌性腸炎、出血等疾病，造成大鱗副泥鰍死亡。5.0 mg/L SDBS組中大鱗副泥鰍未發(fā)現(xiàn)染病現(xiàn)象，但仍有大量大鱗副泥鰍死亡，死亡個(gè)體腹部膨大，鰓和肛門出血，身體表面有大量粘液，與于淑池等[11]的急性毒性實(shí)驗(yàn)中毒癥狀一致。大鱗副泥鰍死亡情況趨勢(shì)線符合三次回歸式拋物線(R2> 0.9)。對(duì)回歸曲線進(jìn)行F檢驗(yàn)[15]，顯著性水平(P=0.007)小于0.05，說(shuō)明60 d內(nèi)大鱗副泥鰍的死亡率與SDBS濃度存在顯著相關(guān)性。根據(jù)概率單位法計(jì)算，SDBS對(duì)大鱗副泥鰍60 d的半致死濃度60 d-LC50為3.615 mg/L。

圖1 SDBS處理60 d大鱗副泥鰍的死亡情況

2.3 性腺的組織學(xué)觀察

2.3.1 SDBS處理60 d精巢的組織學(xué)觀察

從圖2可見(jiàn)，70日齡大鱗副泥鰍經(jīng)60 d飼養(yǎng)，精巢已處于第Ⅴ時(shí)期。各實(shí)驗(yàn)組(B～D組)精小葉分布絮亂，形狀不規(guī)則且小葉邊界模糊，較對(duì)照組(A組)體積小，數(shù)量多，成熟度不均一，次級(jí)精母細(xì)胞較多。各實(shí)驗(yàn)組精巢小囊壁破裂，小葉腔中幾乎充滿成熟精子，只有靠近小葉腔壁處略有空隙。對(duì)照組精小葉體積較大，小葉間間介組織較薄，小葉邊界明顯，成熟精子較多，緊密排列在精小葉中。顯示SDBS明顯抑制了大鱗副泥鰍精巢的發(fā)育。

圖2 SDBS處理60 d的精巢

2.3.2 SDBS處理60 d卵巢的組織學(xué)觀察

各組大鱗副泥鰍卵巢中均存在第Ⅱ時(shí)相至第Ⅴ時(shí)相的卵母細(xì)胞，且各時(shí)相卵母細(xì)胞在數(shù)量和組織學(xué)形態(tài)上與對(duì)照組均無(wú)明顯差別(圖3)?？梢?jiàn)，在本實(shí)驗(yàn)濃度下SDBS處理60 d對(duì)大鱗副泥鰍卵巢發(fā)育沒(méi)有顯著影響。

圖3 SDBS處理60 d的卵巢

3 討論

3.1 SDBS對(duì)大鱗副泥鰍受精卵孵化的影響

SDBS對(duì)大鱗副泥鰍受精卵半致死濃度2 d-LC50為2.935 mg/L，小于尹伊偉[16]等測(cè)得SDBS對(duì)草魚(yú)受精卵半致死濃度(96 h-LC50為4.2 mg/L)，可能與魚(yú)的種類和實(shí)驗(yàn)水溫等因素有關(guān)。SDBS濃度≥2.5 mg/L時(shí)顯著影響了大鱗副泥鰍的胚胎發(fā)育，致使其培育周期和孵化周期延長(zhǎng)，孵化率下降，鰍苗畸形率上升。據(jù)張博文[17]研究，SDBS可抑制人宮頸癌細(xì)胞和中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的增殖。抑制細(xì)胞分裂的原因可能是SDBS插入膜脂，與膜脂或膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域等疏水部分結(jié)合，破壞了膜結(jié)構(gòu)[18]。此外，SDBS能夠抑制機(jī)體的抗氧化作用，使體內(nèi)活性氧增多，可對(duì)DNA造成一定的損傷[19]，影響DNA表達(dá)，進(jìn)而影響受精卵的分裂。

3.2 SDBS對(duì)大鱗副泥鰍死亡率的影響

已有研究表明，SDBS可有效減少魚(yú)體中NBT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，降低SOD、IgM水平，使機(jī)體抗菌能力下降[20-22]。本實(shí)驗(yàn)中0.3～2.5 mg/L SDBS濃度組的大鱗副泥鰍主要因感染細(xì)菌性腸炎等疾病而死亡，分析是SDBS降低了大鱗副泥鰍的抗菌能力所致。但5.0 mg/L SDBS濃度組大鱗副泥鰍未感染細(xì)菌性腸炎等疾病，可能是高濃度SDBS抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)[23]。至于該濃度組中大鱗副泥鰍死亡率更高，推測(cè)是SDBS通過(guò)鰓和皮膚進(jìn)入魚(yú)體，富集于鰓、血液、腎、膽囊、性腺和肝胰臟等組織器官中的量更大[3,24]，導(dǎo)致其中毒死亡。

3.3 SDBS對(duì)大鱗副泥鰍幼魚(yú)性腺發(fā)育的影響

解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)，1.0、2.5、5.0 mg/L SDBS組中大鱗副泥鰍精巢腫大，被膜緊張，有環(huán)狀隆起，水腫現(xiàn)象明顯，無(wú)法使用性腺成熟系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)大鱗副泥鰍性腺發(fā)育情況。觀察精巢組織切片時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有實(shí)驗(yàn)組大鱗副泥鰍精巢的結(jié)構(gòu)遭到損壞，與韓俊娟等[5]對(duì)雄性小鼠的研究結(jié)論一致，推測(cè)可能是大鱗副泥鰍體內(nèi)的ACP含量增高及ALP的活力下降所引起。ACP是溶酶體中一種重要的水解酶，其含量的升高可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，ALP與包括性腺成熟在內(nèi)的多種代謝有關(guān)，其活力的降低可引起魚(yú)類嚴(yán)重的生殖功能障礙[25]。卵巢的組織學(xué)觀察表明，各實(shí)驗(yàn)組卵巢與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異。至于SDBS對(duì)大鱗副泥鰍雌雄性腺發(fā)育影響不同的原因尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

SDBS濃度≥2.5 mg/L時(shí)，大鱗副泥鰍受精卵的培育周期和孵化周期延長(zhǎng)，孵化率下降，鰍苗畸形率上升；大鱗副泥鰍死亡率隨SDBS濃度增加而升高，60 d的半致死濃度為3.615 mg/L；SDBS濃度≥0.1 mg/L時(shí)能抑制精巢發(fā)育。

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