飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉生長性能、 肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)及肝臟相關(guān)基因表達的影響

吳 凡，陸 星，文 華，田 娟，劉 偉，蔣 明，楊長庚，喻麗娟，梁宏偉

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所， 武漢 430223)

中華鱉(Pelodiscussinensis)，俗稱甲魚，是我國主要特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。隨著20世紀(jì)80年代末中華鱉人工繁殖技術(shù)的突破，中華鱉的養(yǎng)殖模式有了較大改進，已逐漸從小規(guī)模的土池養(yǎng)殖進入到集約的溫室化養(yǎng)殖。集約化養(yǎng)殖模式下，中華鱉主要投喂人工飼料，由于我國中華鱉的營養(yǎng)與飼料研究起步較晚，總體來說對其飼料配方的研究還不完善，目前的研究僅見中華鱉對蛋白質(zhì)，脂肪，部分維生素和礦物質(zhì)的需求量及幾種飼料添加劑的應(yīng)用等方面[1-7]。

蛋白質(zhì)和脂肪是兩大重要的營養(yǎng)素，在維持機體生長及代謝調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)養(yǎng)殖階段的不同，中華鱉對蛋白質(zhì)的需求集中在 42%～50%[1-2]，也有研究發(fā)現(xiàn)通過添加營養(yǎng)型添加劑可將中華鱉飼料中的蛋白質(zhì)降到 40% 以下[8]。Huang等[3]以大豆油和魚油作為脂肪源，發(fā)現(xiàn)4.9 g的中華鱉稚鱉對脂肪需求量為 8.8% 。在實際生產(chǎn)中，為保證中華鱉的快速生長，飼料脂肪含量不應(yīng)低于 6%[9]。目前的研究大多關(guān)注營養(yǎng)素對中華鱉的存活率和生長性能的影響，但蛋白質(zhì)和脂肪也能夠直接影響營養(yǎng)物質(zhì)沉積和養(yǎng)殖動物的肉品品質(zhì)。中華鱉營養(yǎng)價值豐富，一直深受消費者的喜愛。近年來隨著生活水平的提高，消費者對中華鱉的品質(zhì)也提出了更高的要求。本研究旨在確定溫室養(yǎng)殖條件下中華鱉飼料中適宜的蛋白質(zhì)與脂肪配比，同時研究飼料蛋白質(zhì)及脂肪水平對中華鱉肌肉營養(yǎng)成分，肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)及肝臟相關(guān)基因表達的影響，以期為制定合理的飼料配方及改善中華鱉的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計與試驗飼料

本試驗采用雙因素試驗設(shè)計中的“3×2”因子設(shè)計，以飼料中蛋白質(zhì)和脂肪水平為試驗因素。

表1 飼料配方及營養(yǎng)成分

注:1.維生素預(yù)混料 (g/kg):維生素A，8;維生素D，1;維生素E，40;維生素K，3;維生素B1，4;維生素B2，4;維生素B6，8;煙酸，32;生物素(2%)，6;泛酸鈣，40;葉酸，2;維生素B12，2;維生素C，60;肌醇，100。

2.礦物鹽預(yù)混物 (g/kg):亞硒酸鈉，0.4;碳酸鈣，350;磷酸二氫鈉，200;磷酸二氫鉀，200;七水硫酸鎂，10;一水硫酸錳，2;二水氯化銅，1;七水硫酸鋅，2;七水硫酸亞鐵，2;氯化鈉，12;碘化鉀，0.1;六水氯化鈷，0.1;六水氯化鋁，1。

蛋白質(zhì)設(shè)三個水平，分別為40%、45%和50%，脂肪設(shè)兩個水平，分別為6%和9%，一共6組試驗飼料，分別命名為40P/6L、45P/6L、50P/6L、40P/9L、45P/9L和50P/9L (P-蛋白質(zhì)，L-脂肪)。飼料以白魚粉、啤酒酵母和大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，豆油為脂肪源。飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

1.2 養(yǎng)殖試驗

養(yǎng)殖試驗在安徽喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司中華鱉養(yǎng)殖場的溫室內(nèi)進行，選擇54 只健康的雄性日本品系中華鱉，均重 (293.11±7.84) g，分成 6 個組，每組 9 只 (3個平行，每個平行3只) ，飼養(yǎng)于18 個長方形塑料箱 (90 cm×60 cm×35 cm) 中，箱中水深25 cm，每個養(yǎng)殖箱中掛3塊網(wǎng)片，供中華鱉攀爬棲息，箱中設(shè)置一塊20 cm×30 cm的食臺，食臺設(shè)在水下2～3 cm。6組中華鱉分別投喂40P/6L、45P/6L、50P/6L、40P/9L、45P/9L和50P/9L的6種飼料。每天上午將飼料加水制成團狀，再以手持式擠壓機將飼料團擠壓成直徑6 mm左右的顆粒，分三次投喂 (8∶30、13∶30和18∶30) ，每次投喂量以20 min之內(nèi)吃完為宜，如投喂20 min后仍有殘餌，則回收烘干稱重。每晚20∶00以虹吸法吸取養(yǎng)殖箱中糞便，并補充新水至25 cm高度。溫室內(nèi)溫度控制在 (32±1) ℃，養(yǎng)殖試驗進行56 d。

1.3 試驗采樣

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，將中華鱉禁食 24 h后稱重，計算增重率、特定生長率及飼料系數(shù)。將中華鱉從頸部放血，將背甲與腹甲分離，解剖取出肝臟并稱重，用于計算肝體比。將肝臟取一小塊樣品放入 1.5 mL 離心管，迅速放入液氮中冷凍保存，用于檢測肝臟igf-I，lpl基因 mRNA 表達水平。取四肢肌肉樣品，分成兩份，一份儲存于 4 ℃ 冰箱，用于檢測肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，另一份儲存于 -20 ℃ 冰柜，用于基本營養(yǎng)成分檢測。

1.4 檢測分析

根據(jù)以下公式，計算增重率、特定生長率、飼料系數(shù)和肝體比。

增重率 (WG)=(末重-初重) ×100%/初重

特定生長率(SGR)=[ln(末重)-ln(初重)]×100%/飼養(yǎng)時間(d)

飼料系數(shù) (FCR)=飼料攝入量/ (末總重-初總重)

肝體比 (HSI)=(肝臟重/個體重)×100%

將肌肉樣品，切成 1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 規(guī)格，采用 TVT-300XP 型質(zhì)構(gòu)儀 (波通瑞華科學(xué)儀器北京有限公司) 進行質(zhì)地剖面分析法 (texture profile analysis，TPA) 測定，探頭為P-cy50s 圓柱型探頭，采用兩次檢測法，測試前速度為2 mm/s；測試后速度為2 mm/s；測試速度為1 mm/s；測定間隔時間為5 s；壓縮比為60%；觸發(fā)力為98 mN；數(shù)據(jù)獲得速率為200.00 pps。每只鱉取兩塊肌肉樣品，檢測肌肉的硬度、粘聚性、彈性、回復(fù)性、膠著性和咀嚼性等指標(biāo)。

飼料和肌肉樣品的水分含量采用105 ℃恒溫干燥失重法測定；粗脂肪采用索氏抽提法測定；粗蛋白采用凱氏定氮法測定；灰分采用馬福爐灰化法測定。

按照TRIZOL試劑盒 (Invitrogen) 的說明書提取肝臟總RNA。將RNA樣品用RNase-free DNase I (Takara) 在 37 ℃下消化 30 min 以除去殘余的DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測總RNA的完整性和質(zhì)量。用Revert AidTM First-Stran試劑盒 (Fermentas) 將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈 cDNA。定量PCR反應(yīng)根據(jù)天根生化公司的SYBR Green Real Master Mix進行(ABI 7500 熒光定量PCR儀)。根據(jù)NCBI Genebank基因序列及管家基因β-actin序列，通過Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物序列，見表2。所有的反應(yīng)采用20 μL體系。反應(yīng)的熱循環(huán)條件如下：95 ℃ 5 min，1循環(huán)；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共計 40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)以第一組為參照，使用2-△△Ct方法計算目的基因表達量[10]。

表2 定量PCR的特異性引物以及擴增片段長度

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Spss 18統(tǒng)計軟件中雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)和Duncan’s氏多重比較法對試驗結(jié)果的差異顯著性進行分析處理，試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P< 0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉生長性能的影響

不同飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉的存活率無影響，各組的中華鱉存活率均為 100%。由表3可知，飼料蛋白質(zhì)水平顯著影響中華鱉的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)和肝體比。45% 和 50% 組的增重率和特定生長率無顯著差異，但顯著高于 40% 組，45% 組的飼料系數(shù)顯著低于40%組，肝體比則呈相反趨勢，隨著蛋白質(zhì)水平升高而上升，50% 組顯著高于 40% 組。脂肪水平對增重率、特定生長率和飼料系數(shù)均無顯著影響，但 9% 組的肝體比顯著高于 6% 組。結(jié)果顯示，飼料中蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉的生長性能及肝體比均無顯著的交互作用。

表3 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉生長性能和飼料利用的影響

注：同一列數(shù)據(jù)有不同上標(biāo)字母表示有顯著差異 (P<0.05) 。下表同。

2.2 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉成分的影響

由表4可知，飼料不同蛋白質(zhì)水平對中華鱉肌肉水分、粗脂肪和粗灰分含量無顯著影響，但顯著影響肌肉粗蛋白含量，45% 和50%組顯著高于40% 組，但45% 和50% 組之間并無顯著差異。飼料脂肪水平對肌肉水分、粗蛋白和粗灰分含量無顯著影響，9% 脂肪組的粗脂肪含量顯著高于6% 組。結(jié)果顯示，飼料中蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉的營養(yǎng)成分均無顯著的交互作用。

2.3 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的影響

由表5可知，飼料不同蛋白水平和脂肪水平均顯著影響中華鱉肌肉硬度、黏性和咀嚼性，蛋白質(zhì)水平50%組肌肉的硬度和黏性顯著高于40%和45%組，咀嚼性顯著高于40%組。脂肪水平9%組的硬度，黏性和咀嚼性顯著低于6%組。飼料蛋白質(zhì)及脂肪水平均對回復(fù)性、彈性和凝聚性無顯著影響。結(jié)果顯示，飼料中蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)均無顯著的交互作用。

表4 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉成分的影響

表5 飼料不同蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的影響

2.4 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肝臟相關(guān)基因表達的影響

如表6所見，飼料蛋白水平能顯著提高中華鱉肝臟中igf-I基因 mRNA 表達水平，40%、45% 和 50% 組之間均存在顯著差異。但對lpl基因相對表達量無顯著影響。脂肪水平顯著影響肝臟中igf-I和lpl基因mRNA 表達水平，9% 組顯著高于 6% 組。結(jié)果顯示，飼料中蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肝臟igf-I基因 mRNA 表達水平有顯著的交互作用，對lpl基因mRNA 表達水平無交互作用。

表6 飼料不同蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肝臟igf-I和lpl基因表達的影響

3 討論

3.1 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉生長性能的影響

本研究中，各個養(yǎng)殖箱中華鱉的存活率均為 100%，說明中華鱉可以較好的適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境及不同蛋白質(zhì)及脂肪水平的飼料。中華鱉的增重率在 31.56%～41.90% 之間，這主要與爬行動物生長緩慢有關(guān)，本試驗選取的初始體重300 g左右的中華鱉，其生長速度要低于稚鱉[11]。當(dāng)飼料蛋白質(zhì)水平由 40% 升高到 45% 時，鱉的增重率和特定生長率均顯著上升，當(dāng)繼續(xù)上升到 50% 時，生長性能卻并未繼續(xù)升高。Nuangsaeng等[1]對初始體重為 5.1 g 的稚鱉的研究也有類似結(jié)果。本試驗中 45% 組的飼料系數(shù)顯著低于 40% 組，但 50% 組并未下降，反而比 45% 組略有上升，在團頭魴 (Megalobramaamblycephala)[12]和赤眼鱒(Squaliobarbuscurriculus)[13]中也有相同結(jié)果。說明當(dāng)飼料蛋白質(zhì)水平達到養(yǎng)殖動物的適宜需求量后再繼續(xù)提高，會增加機體的代謝負(fù)擔(dān)，生長指標(biāo)反而進入平臺期或下降期。

由于中華鱉飼料中主要使用白魚粉等優(yōu)質(zhì)的動物蛋白源，過高的蛋白質(zhì)水平會提高飼料成本。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水平過高時，部分蛋白質(zhì)還可能被當(dāng)作能量消耗。本試驗中，肝體比隨著蛋白質(zhì)水平升高而上升，說明過多的蛋白質(zhì)可能分解供能，以能量形式儲存于肝臟，并沒有用于鱉的生長。結(jié)果表明 45% 的蛋白質(zhì)水平可滿足中華鱉的生理需求，這和以往的研究結(jié)果[1-2]相差不大，也和大鱗鲃 (Barbuscapito，43.09%～44.15%)[14]、南方鲇 (Silurusmeridionalis，45%)[15]等偏肉食性魚類的需求量結(jié)果基本一致。

脂肪作為重要的能量物質(zhì)，為鱉的生長發(fā)育提供能量，并協(xié)助脂溶性維生素的吸收和體內(nèi)運輸。本研究中，6% 和 9% 組并未出現(xiàn)顯著差異，說明飼料中 6% 的脂肪即可滿足鱉的生長，當(dāng)脂肪水平繼續(xù)上升到 9% 時，飼料中能量也相應(yīng)升高，過高的能量可能影響了中華鱉的攝食，因此其生長性能并未持續(xù)上升。6%的結(jié)果要低于Huang等[3]對中華鱉稚鱉的研究結(jié)果 8.8%，生長階段的不同應(yīng)該是主要原因。稚鱉由于生長速度快于成鱉，其生長代謝旺盛，對于營養(yǎng)素的需求也要高于成鱉。Huang等[3]的研究中還發(fā)現(xiàn)，飼料中過多的脂類并未被中華鱉用于生長，而是被用于合成不飽和脂肪酸等以維持其自身的正常生長發(fā)育。本試驗中隨著脂肪水平的升高，肝體比顯著上升，這種現(xiàn)象在團頭魴[12]和黑線鱈 (Melanogrammusaeglefinus)[16]中也有發(fā)現(xiàn)。由于肝臟是脂肪代謝的主要場所，攝入超出機體代謝范圍的脂肪容易沉積在肝臟，可能會對肝臟造成不良影響[17]。

3.2 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉成分的影響

在本研究中，飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉的水分和粗灰分含量均無顯著影響，各組的含量均比較穩(wěn)定。當(dāng)飼料蛋白質(zhì)水平≥45% 時，中華鱉肌肉的粗蛋白含量要高于 40% 組。說明當(dāng)機體通過飼料攝入的蛋白質(zhì)增加時，在腸道內(nèi)分解為氨基酸的量也增加，因而通過血液進入肌肉組織中的氨基酸含量增多，蛋白質(zhì)合成增強，因此肌肉蛋白質(zhì)含量顯著升高。結(jié)果表明 45% 的飼料蛋白質(zhì)水平能提高中華鱉的肌肉蛋白質(zhì)含量，提高其營養(yǎng)價值。

肌肉脂肪含量隨著飼料脂肪水平的上升而升高，對細鱗鮭 (Brachymystaxlenok)[18]和斑點叉尾鮰 (IctalurusPunctatus)[19]的研究結(jié)果也有相似結(jié)果。說明肌肉營養(yǎng)成分主要受飼料中相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)水平的影響。宋理平等[20]比較了仿生和溫室養(yǎng)殖中華鱉的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)仿生中華鱉的肌肉脂肪含量要低于溫室鱉。由于溫室鱉養(yǎng)殖在室內(nèi)，養(yǎng)殖密度較大，受養(yǎng)殖環(huán)境限制鱉的活動也較少，更容易造成脂肪沉積，因此溫室養(yǎng)殖條件下更應(yīng)注意中華鱉飼料中的脂肪水平，避免添加量過高。

3.3 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的影響

質(zhì)地剖面分析是利用質(zhì)構(gòu)儀模擬人的咀嚼運動對樣品進行兩次壓縮，記錄時間和力的關(guān)系，通過測試曲線分析出與質(zhì)構(gòu)特性相關(guān)的一系列參數(shù)，包括硬度、回復(fù)性、黏性、咀嚼性、彈性、凝聚性[21]。硬度反映了樣品的內(nèi)部結(jié)合力，是非常重要的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，硬度低的肉品其肉質(zhì)較松散，不容易得到消費者的認(rèn)可[22]。本研究中，蛋白質(zhì)和脂肪水平的變化均顯著影響了肌肉硬度。隨著飼料蛋白質(zhì)水平的升高，肌肉硬度呈上升趨勢，并在 50% 時出現(xiàn)顯著差異，說明蛋白質(zhì)水平的升高可能增加了肌肉間的結(jié)合力，使肌肉硬度上升。柳明等[23]研究了不同飼料營養(yǎng)水平對長吻鮠 (Leioeasislongirostris) 肉質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)高蛋白飼料養(yǎng)殖的魚類的肌肉硬度更高，推測可能是由于肌纖維密度更高。

Haard[24]認(rèn)為人工養(yǎng)殖魚類的肉質(zhì)不如野生魚類結(jié)實，主要是由于人工養(yǎng)殖魚類體內(nèi)容易積累更多的脂肪。本研究中，肌肉脂肪含量高的組其肌肉硬度下降，這與對斑點叉尾鮰[25]的研究一致，這可能是由于高脂肪含量使得肌間脂肪含量升高，肌肉肥膩而質(zhì)地松軟，導(dǎo)致肌肉的機械強度降低。但Faergemand等[26]對虹鱒 (Oncorhynchusmykiss) 的研究表明，魚肉脂肪含量增加并未影響肉質(zhì)硬度，這可能與養(yǎng)殖品種的差異有關(guān)。研究中彈性、回復(fù)性、凝聚性等參數(shù)雖未受到飼料營養(yǎng)水平的影響，但是黏性是硬度與凝聚性的乘積，咀嚼性是硬度、凝聚性和彈性的乘積，都屬于質(zhì)構(gòu)指標(biāo)中的綜合參數(shù)，因此與硬度的變化趨勢一致。肉品的質(zhì)構(gòu)特性主要受肌纖維的組織學(xué)特性的影響，而飼料營養(yǎng)水平可以影響肌纖維的密度和直徑等從而改善肌肉品質(zhì)[27]，這也提示我們從微觀結(jié)構(gòu)上觀察肌纖維將有助于更完善的評價肉質(zhì)。

3.4 飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平對中華鱉肝臟相關(guān)基因表達的影響

胰島素樣生長因子 (igf-I) 也稱生長介素，是生長激素軸的組成部分，在動物的生長、代謝、繁殖等過程中發(fā)揮重要作用。營養(yǎng)物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)igf-I的表達來影響動物的生長，因此飼料營養(yǎng)水平可以影響igf-I的表達與合成[28]。Brameld等[29]認(rèn)為，蛋白質(zhì)主要以氨基酸形式調(diào)控igf-I基因的表達。本研究中隨著蛋白質(zhì)水平的升高，肝臟igf-I基因表達顯著升高，脂肪水平對中華鱉的影響也呈現(xiàn)相同的趨勢。說明蛋白質(zhì)和脂肪作為重要的營養(yǎng)素，顯著影響了肝臟igf-I基因表達，這和柳陽對大西洋鮭 (Salmosalar) 的研究結(jié)果一致[30]。但生長性能上僅有45%蛋白組顯著高于40%組，兩個脂肪水平之間未產(chǎn)生顯著差異，這可能是由于中華鱉是生長速度較慢的爬行動物，在較短的試驗周期內(nèi)并未出現(xiàn)生長上的差異，也可能是過多的蛋白質(zhì)和脂肪主要用于中華鱉體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的沉積。

脂蛋白酯酶 (lpl) 作為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，可以促進甘油三酯分解，并釋放游離脂肪酸貯存在肝臟[31]。 對瓦氏黃顙魚 (Pelteobagrusvachelli)[32]和吉富羅非魚 (Oreochromisniloticus)[33]的研究表明，攝食高脂飼料組的魚類肝臟lpl基因表達水平顯著升高。本研究中9%脂肪組的中華鱉肝臟lpl基因mRNA表達水平顯著高于6%組，這與前人的研究結(jié)果一致，說明增加飼料脂肪含量可以誘導(dǎo)中華鱉肝臟分泌lpl，促進脂肪酸的消化吸收。中華鱉的肝體比和肌肉脂肪含量也呈現(xiàn)相同的變化趨勢，說明lpl通過調(diào)控其在脂肪組織與其他組織器官表達水平的變化，決定了機體脂肪的蓄積狀況。

4 結(jié)論

根據(jù)本試驗中華鱉生長、肌肉營養(yǎng)成分、肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和肝臟相關(guān)基因表達的研究結(jié)果，建議中華鱉飼料適宜的蛋白質(zhì)和脂肪水平分別為45%和6%，溫室養(yǎng)殖條件下應(yīng)注意脂肪的添加量，避免脂肪過多沉積，對肝臟造成不良影響。

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