甲狀腺球蛋白基因外顯子33單核苷酸多態(tài)性與Graves’病停藥后復(fù)發(fā)的關(guān)系

盧洪文 黃靈玉 王雪松 張蓓（通訊作者）

（1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 山東 青島 266071）

（2濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 山東 濰坊 261041）

GD是臨床常見(jiàn)自身免疫性甲狀腺疾病，促甲狀腺激素受體抗體分泌水平異常增加所致甲狀腺功能亢進(jìn)是GD發(fā)病的最主要因素[1]。臨床常采用ATD、手術(shù)、碘131等治療方法，以ATD治療為主，但停藥后復(fù)發(fā)率較高。近來(lái)針對(duì)GD的研究集中在基因抗原方面[2-3]，研究顯示甲狀腺球蛋白（Tg）E33SNP與GD的發(fā)病密切相關(guān)，但較少涉及到Tg基因外顯子多態(tài)性與GD停藥后復(fù)發(fā)之間的關(guān)聯(lián)性[4]。本研究對(duì)108例山東濰坊地區(qū)漢族GD患者進(jìn)行臨床資料回顧分析，探討E33SNP與GD停藥后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年9月—2016年12月期間在濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的GD患者108例為研究對(duì)象，均只接受ATD治療18個(gè)月以上。根據(jù)GD患者停藥后復(fù)發(fā)時(shí)間的不同分組：將停藥后1年內(nèi)GD復(fù)發(fā)者設(shè)為A組（38例，男性4例，女性34例，年齡20～60歲，平均40.2±10.1歲）；將停藥后1～2年GD復(fù)發(fā)者為B組（37例，男性7例，女性30例，年齡為19～58歲，平均41.3±11.5歲）；將停藥后2年內(nèi)GD未復(fù)發(fā)者為C組（33例，男性6例，女性27例，年齡為21～62歲，平均40.8±12.9歲）；另選擇我院體檢中心健康查體者排除GD共33例作為對(duì)照組（男性9例，女性24例，年齡25～60歲，平均40.5±12.3歲）。

各組一般資料對(duì)比差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 E33SNP基因型檢測(cè) 采集外周血2.0ml（EDTA抗凝），以血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以超微量核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)其濃度，提取濃度A260/A280介于1.8，2.0范圍，樣本置于-20.0℃冷凍保存?zhèn)錅y(cè)。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)樣本E33SNP多態(tài)性并進(jìn)行基因分型，引物由上海生工公司提供。PCR反應(yīng)體系：模板1ul，上下游引物各1ul，2X HS TaqE mix 10 ul，20X EvaGreen 1ul，加ddH2O至20ul。PCR反應(yīng)條件：94.0℃ 5.0min，94.0℃ 10.0s，65.0℃ 30.0s，72.0℃30.0s，循環(huán)反應(yīng)35次，72.0℃ 10.0min。反應(yīng)完成后以GeneScanning軟件分析處理，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收后外送進(jìn)行基因測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰譜圖對(duì)E33SN基因型進(jìn)行判斷。

1.2.2 觀察指標(biāo) 比較各組受檢對(duì)象基因型頻率、等位基因頻率以及停藥后緩解期不同基因型GD患者甲狀腺功能指標(biāo)（TRAb、Tg、TSH、FT3、FT4，免疫化學(xué)發(fā)光法）進(jìn)行分析。

表2 不同基因型患者甲狀腺相關(guān)功能指標(biāo)對(duì)比

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 相關(guān)數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析，以（±s）表示計(jì)量資料，經(jīng)t檢驗(yàn)；以率（%）表示計(jì)數(shù)資料，經(jīng)χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

觀察組內(nèi)A 組CC基因型患者構(gòu)成比顯著高于B組及C組，CT型患者構(gòu)成比顯著低于B組以及C組，C等位基因明顯高于C組，T等位基因明顯低于C組；B組CC型患者構(gòu)成比顯著高于C組。觀察組和對(duì)照組的基因型頻率、等位基因頻率差異無(wú)顯著性。見(jiàn)表1。

表1 各組基因型頻率、等位基因頻率對(duì)比

各觀察組CC基因型患者TRAb水平均顯著高于組內(nèi)其他基因型。不同基因型患者FT3、FT4、TSH、Tg差異無(wú)顯著性。見(jiàn)表2。

3.討論

導(dǎo)致GD復(fù)發(fā)的因素有多種，除去遺傳因素外，非遺傳因素如應(yīng)激、年齡、性別、吸煙、病程、甲狀腺疾病家族史、碘鹽的攝取等也對(duì)GD復(fù)發(fā)有重要影響，具體機(jī)制比較復(fù)雜。大多數(shù)的研究針對(duì)GD復(fù)發(fā)的非遺傳性因素，較少涉及到遺傳性因素對(duì)GD復(fù)發(fā)的影響[5-6]。以往研究表明GD的ATD使用需2年以上的長(zhǎng)程治療，療程較短緩解率很低。療程達(dá)到2年后也應(yīng)認(rèn)真評(píng)估后再考慮是否停藥，否則復(fù)發(fā)的可能性大。

E33SNP是近年來(lái)Tg基因研究較多的多態(tài)性位點(diǎn)，有關(guān)報(bào)道中針對(duì)我國(guó)不同地區(qū)漢族人群Tg基因多態(tài)性與AITD的關(guān)系進(jìn)行了分析，顯示E33SNP與GD的發(fā)生具相關(guān)性[7-8]，但不同地區(qū)、不同種族的人群其E33SNP各基因型頻率、等位基因頻率及是否與GD發(fā)生相關(guān)具有一定的差異性。

本研究針對(duì)山東濰坊地區(qū)漢族人群不同時(shí)段復(fù)發(fā)GD患者E33SNP進(jìn)行研究與分析，顯示A組CC型患者構(gòu)成比顯著高于B組和C組，CT型患者構(gòu)成比為顯著低于B組和C組；B組CC型患者構(gòu)成比顯著高于C組。針對(duì)各觀察組基因型GD患者甲狀腺功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CC基因型患者TRAb水平均顯著高于組內(nèi)其他基因型。提示甲狀腺球蛋白E33SNP C/C型患者是GD停藥后短期內(nèi)復(fù)發(fā)的最高危人群，應(yīng)考慮在ATD治療時(shí)延長(zhǎng)低劑量維持給藥時(shí)間，以降低復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后水平。

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