基于微通道傳感器與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的牛奶體細(xì)胞數(shù)定量檢測方法研究

張學(xué)超 崔傳金 張曉晨（①銅仁學(xué)院大數(shù)據(jù)學(xué)院 貴州 銅仁 554300 華北理工大學(xué) 唐山市先進(jìn)測試與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 唐山）

奶牛乳腺炎(Cow Mastitis)是奶牛所有疾病中發(fā)病率最高，危害最嚴(yán)重的一種疾病，美國每年因奶牛乳腺炎疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20.00億美元[1-2]。2016年全球原料奶產(chǎn)量高達(dá)8.17億t，中國原料奶產(chǎn)量僅3570萬t，奶牛單產(chǎn)僅8.3t，同年進(jìn)口乳制品折合生鮮乳約1200萬t[3]。同期，美國牛奶總產(chǎn)量為9471萬t，奶牛單產(chǎn)高達(dá)10.27t，但生鮮乳價格卻僅為3.2元/kg，我國均價高達(dá)4.05元/kg[4]。此外，我國人均乳品消費(fèi)量僅為世界平均水平的1/3[5]，說明我國乳品市場還有巨大增長空間。Litwinczuk等[6]研究表明，原奶中的體細(xì)胞數(shù)(Somatic Cell Count，SCC)與日產(chǎn)奶量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，平均SCC每提高1個水平，日產(chǎn)奶量下降0.13kg。金亞東[7]等研究表明，SCC與日產(chǎn)奶量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，平均SCC水平每升高1個單位，日產(chǎn)奶量下降約1.3kg。因此，按照CMT檢測標(biāo)準(zhǔn)，若能盡早檢測出奶牛(隱性)乳腺炎疾病，理論上奶牛日單產(chǎn)約增4.48kg。由此可見，若要改變我國乳品市場的競爭格局，關(guān)鍵要提高奶牛單產(chǎn)和原奶品質(zhì)，而原奶中體細(xì)胞數(shù)與奶牛乳腺炎患病等級、牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)[8,9]；2016年中國農(nóng)墾乳業(yè)聯(lián)盟發(fā)布《中國農(nóng)墾生鮮乳生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，新增體細(xì)胞數(shù)檢測指標(biāo)，規(guī)定40萬個/ml以下為合格乳[10]。因此，迫切需要研發(fā)能夠在線檢測奶牛乳腺炎患病等級、牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)的新型傳感器。在體細(xì)胞數(shù)的所有檢測方法中，電檢測法具有方便快捷、檢測成本低和實(shí)時在線檢測等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊[11]。然而，體細(xì)胞數(shù)與電導(dǎo)率[12]和電容[13]有一定相關(guān)關(guān)系；溫度對測量電容參數(shù)也有重要影響[14]。在特定溫度條件下，試驗(yàn)通過微通道傳感器測取不同細(xì)胞含量的新鮮奶樣電導(dǎo)率和電容值，并用低頻區(qū)域的電導(dǎo)率和電容值建立預(yù)測體細(xì)胞含量的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，最終達(dá)到準(zhǔn)確、快速、在線診斷奶牛乳腺炎和評判原奶產(chǎn)量和品質(zhì)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

美國GAMRY 600電化學(xué)工作站；美國HERA CELL 150i二氧化碳培養(yǎng)箱；日本OLYMPUS CKX301倒置顯微鏡；日本OLYMPUS CX21生物光學(xué)顯微鏡；北京科偉永興79-1磁力加熱攪拌器；上海舜宇DC-0515低溫恒溫槽；上海GI208離心機(jī)；BCD-219SKDE冷藏柜；真空泵；高精度溫度計等，主要數(shù)據(jù)分析處理采用MATLAB R2012b軟件。

1.2 方法

1.2.1 奶樣采集 奶樣采自100多頭同一品種的荷斯坦奶牛。在奶樣采集過程中，需要將分娩后1個月內(nèi)的奶牛和泌乳后期的奶牛除去[13]。采樣時先用溫開水擦拭乳頭，然后用75%的乙醇對乳頭進(jìn)行消毒，并用干凈的醫(yī)用棉簽擦干，且棄去前2次擠出的牛奶，再進(jìn)行奶樣采集。每個乳區(qū)的牛奶分別擠入50ml干凈的帶有編號的玻璃瓶內(nèi)密封，在運(yùn)輸?shù)倪^程中放入裝有冰袋的隔熱泡沫塑料盒內(nèi)進(jìn)行保鮮。最后將當(dāng)天采集的奶樣帶回實(shí)驗(yàn)室測試，來不及立刻測試的奶樣需在4℃條件下冷藏保存，防止牛奶變質(zhì)而影響測試效果。

1.2.2 測試奶樣配制（1）原奶中細(xì)胞含量的檢驗(yàn)采用改進(jìn)的顯微鏡直接計數(shù)法，即碘酊染液染色，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。將奶樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，將裝有奶樣的奶樣瓶放入低溫恒溫槽中，在40℃的恒溫條件下恒溫15min后取出[15]，再用磁力加熱攪拌器攪拌3min，使得奶樣中的體細(xì)胞、脂肪滴等物質(zhì)均勻分散，便于體細(xì)胞過濾和防止脂肪滴等物質(zhì)因凝聚而堵塞濾膜。最后用真空泵對預(yù)處理的奶樣進(jìn)行負(fù)壓過濾，得到無細(xì)胞含量的奶樣；同時配置碘酊染液，進(jìn)行生物光學(xué)顯微鏡細(xì)胞計數(shù)，觀測結(jié)果如圖1所示。（2）為解決特定乳腺炎患病等級體細(xì)胞含量的奶樣采集困難問題，試驗(yàn)中使用具有相似細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的K562細(xì)胞替代奶樣中的體細(xì)胞。為此，將K562細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示。（3）將培養(yǎng)后的K562細(xì)胞與過濾后的奶樣進(jìn)行細(xì)胞含量配置，分別配置為0、10、20、40、80、160、320、640萬/ml的待測奶樣，同時將配置好的不同濃度梯度的奶樣進(jìn)行鏡檢計數(shù)，以便驗(yàn)證奶樣配置的準(zhǔn)確性。（4）試驗(yàn)中，同一奶樣重復(fù)鏡檢計數(shù)5次，取其平均值作為牛奶體細(xì)胞最終含量。共測取120份奶樣，并根據(jù)加利福尼亞CMT標(biāo)準(zhǔn)[14]，將奶樣劃分為5個等級，見表1。

圖1 過濾后無細(xì)胞奶樣

圖2 培養(yǎng)后的K562細(xì)胞

表1 CMT法檢測奶牛乳腺炎的標(biāo)準(zhǔn) (萬個/ml)

1.2.3 牛奶電容和電導(dǎo)率測量 因?yàn)闇囟葘y量牛奶電容有影響較大[14]，同時考慮在線檢測和正常情況奶牛體溫兩因素，確定38.6℃為試驗(yàn)測試溫度。因此，將裝有測試奶樣的微通道傳感器(預(yù)熱30min，以保證熱傳遞達(dá)到平衡)置于38.6℃的低溫恒溫槽中進(jìn)行測試，同時使用高精度溫度計驗(yàn)證低溫恒溫槽中的水溫是否符與測試溫度一致。最后使用GAMRY 600電化學(xué)工作站測量在10Hz～1MHz頻率范圍內(nèi)的電阻和電抗值，并根據(jù)微通道傳感器的具體結(jié)構(gòu)參數(shù)轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的電導(dǎo)率和電容值。同時，為了避免測試奶樣之間相互交叉污染，每測試完1個奶樣后，注射器和微通道傳感器都必須用超純水清洗干凈，并用下一個測試奶樣沖洗3次，再進(jìn)行測試。所有奶樣均在采集后的12h內(nèi)測試完畢。

2 結(jié)果

2.1 微通道傳感器的設(shè)計

（1）微通道傳感器電極采用99.99%的高純度金，并濺射到玻璃基片上；同時微通道管體選用透明、絕緣性好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，并用氧等離子技術(shù)進(jìn)行處理，以最大限度減少在通道內(nèi)部產(chǎn)生氣泡，同時也有助于基片與蓋片的永久封和[16]。微通道傳感器由北京博奧生物技術(shù)有限公司代工。（2）為突出傳感器的容抗作用和降低感抗干擾，根據(jù)公式Xc=1/(ωc)=1/(2πfc)。式中：Xc為容抗，c為電容，ω為電極兩端激勵源信號角頻率，f為激勵源信號頻率。在激勵源信號頻率一定的情況下，要想得到較高的容抗，只能減小測試電極的電容，又根據(jù)c=ξ0ξrA/L。式中：ξ0為絕對電容率，ξr為相對電容率，A為電極的橫截面積，L為電極間距離。正是基于減小電極橫截面積和增加傳感器長度2種方式來增加容抗；同時考慮到方便進(jìn)樣和進(jìn)一步減小界面電容等因素。因此，設(shè)計了如圖3所示的微通道傳感器，具體參數(shù)見表2。

圖3b 微通道傳感器微觀尺寸圖

表2 微通道傳感器參數(shù)

2.2 基于電導(dǎo)率和電容的細(xì)胞含量神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

（1）將奶樣電導(dǎo)率和電容值2個向量作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[17]輸入，輸入層神經(jīng)元數(shù)為2。網(wǎng)絡(luò)輸出向量為體細(xì)胞數(shù)，輸出神經(jīng)元數(shù)為1。該網(wǎng)絡(luò)采用2個隱層，2個隱層之間傳遞函數(shù)為Tansig，輸出層函數(shù)為Purelin，訓(xùn)練函數(shù)為Trainlm。在網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練前，將數(shù)據(jù)用Mapstd標(biāo)準(zhǔn)化函數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，以避免數(shù)據(jù)飽和并加速網(wǎng)絡(luò)的收斂速度。（2）通過調(diào)整隱層的節(jié)點(diǎn)數(shù)和相關(guān)的訓(xùn)練參數(shù)對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。經(jīng)過多次的訓(xùn)練仿真發(fā)現(xiàn)，當(dāng)最大迭代次數(shù)為1000，誤差性能目標(biāo)值為0.0001。網(wǎng)絡(luò)模型的2個隱層神經(jīng)元數(shù)為4和2時，結(jié)果較為滿意，模型結(jié)構(gòu)為2-4-2-1，見圖4。

圖4 網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 傳感器模型（1）傳感器模型分析(長12mm)。

圖5 建模數(shù)據(jù)模型線性回歸曲線

圖6 預(yù)測數(shù)據(jù)模型線性回歸曲線

（2）傳感器模型分析(長48mm)。

圖7 建模數(shù)據(jù)模型線性回歸曲線 圖8 預(yù)測數(shù)據(jù)模型線性回歸曲線

（3）表3、表4分別為傳感器的模型評價參數(shù)和各級正確檢出率。

表3 模型評價參數(shù)

表4 各級正確檢出率 (%)

3.2 模型處理結(jié)果分析

（1）由表3可知，該模型建模結(jié)果準(zhǔn)確，呈極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R分別為0.99995和0.99537；模型均方根誤差RMSE分別為2.06739944和20.2285328。并由圖5、圖7可知，建模模型的決定系數(shù)R2分別為0.9999和0.99076，說明針對該類型傳感器所建立的奶牛乳腺炎檢測模型符合檢測要求。同時預(yù)測數(shù)據(jù)模型預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確，也呈極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R分別為0.99996和0.99652；模型均方根誤差RMSEp分別為1.94165127和18.428302。并由圖6、圖8可知，預(yù)測數(shù)據(jù)模型的決定系數(shù)R2分別為0.99992和0.99305，說明針對該類型傳感器所建立的奶牛乳腺炎預(yù)測檢測模型符合檢測要求。（2）預(yù)測數(shù)據(jù)模型對14個建模后剩余的奶樣(每級11.67%的和)進(jìn)行預(yù)測，正確檢出率均為85.71%。120個奶樣的總體檢出率分別為88.33%和90.00%，優(yōu)于S.Ankinakatte等[18]研究的用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)檢測乳腺炎的75%檢出率；略低于崔傳金等[19]使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)檢測法在常規(guī)傳感器檢測條件下的95%乳腺炎檢出率，但是在BP網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度、迭代次數(shù)和誤差性能目標(biāo)等方面均顯著優(yōu)于其模型指標(biāo)。該微型傳感器與崔傳金等研究的常規(guī)傳感器相比較，檢測優(yōu)勢明顯，所需奶樣檢測量驟減。（3）在各級奶樣的檢出率方面，N級和T級奶樣的檢出率偏低，尤其T級檢出率更為嚴(yán)重，檢出率分別為N-86.67%、T-46.67%(12mm)和N-86.67%、T-60.00%(48mm)，但是1、2、3級的正確檢出率均為100%。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因很可能在于體細(xì)胞含量上，在N級和T級中，測試奶樣的最高細(xì)胞含量一般不會超過40萬個/ml，很大一部分細(xì)胞奶樣不高于20萬個/ml。因此，奶樣所產(chǎn)生的奶體電容和奶體電導(dǎo)率信息較少，與電極極化的界面電容和整體電導(dǎo)率相比較，所占權(quán)重小，其有效信息被淹沒，最終導(dǎo)致N級和T級的檢出率偏低。但48mm的微通道傳感器因其管道長度的增加，在低頻測試時不但極大增加了奶體的測試容抗，同時還進(jìn)一步提升了對感抗的抗干擾能力，并且還增大了奶體的充放電時間常數(shù)，使得奶體電容更易捕獲，所以測得的電容值更接近真實(shí)奶體電容值，故在T級檢出率上明顯優(yōu)于12mm的微通道傳感器模型檢測結(jié)果。同時，由于1、2、3級奶樣的細(xì)胞含量顯著上升，這時電容值和電導(dǎo)率的大小就能很好地反映奶樣細(xì)胞含量的變化。因此，模型對1、2、3級的正確檢出率均達(dá)到100%。

4 結(jié)論

通過使用微通道傳感器來獲取阻抗數(shù)據(jù)，并建立相關(guān)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型來實(shí)現(xiàn)原奶中體細(xì)胞數(shù)的定量檢測。結(jié)果表明：在特定檢測溫度下，用電導(dǎo)率和電容值建立與細(xì)胞含量之間的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型整體可行，模型和預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)、均方根誤差和決定系數(shù)均較高，能達(dá)到定量預(yù)測原奶中體細(xì)胞數(shù)的目的。但在N級和T級細(xì)胞濃度下，檢出率偏低，是因?yàn)槟腆w阻抗很大程度上被電極極化的界面阻抗所淹沒。因此，進(jìn)一步研究更加合理的微通道傳感器結(jié)構(gòu)，降低或消除界面阻抗對奶體阻抗的干擾，有望進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)微通道傳感器對原奶中體細(xì)胞數(shù)的檢測精度。

[1] MUNGUBE E O, TENHAGEN B A, REGASSA R, etal. Reduced milk production in udder quarter with subclinical mastitis and associated economic losses in crossbred dairy cows in Ethiopia[J]. Tropical Anim Health Prod, 2005, 37(6): 503-512.

[2]VIGUIER C,ARORA S, GILMARTIN N, etal.Mastitis detection:durrent trends and future perspectives[J]. Trends Biotechnol, 2009, 27(8):486-493.

[3] 李勝利. 2016年奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)發(fā)展報告[J]. 中國畜牧雜志, 2017.53(1): 156-164.

[4] 張潔等. 我國牛奶安全生產(chǎn)現(xiàn)狀及對策[J]. 草業(yè)科學(xué), 2017. 1. 34.138-151.

[5] 中國奶業(yè)質(zhì)量報告[J]. 新疆畜牧業(yè), 2016. 10, 9-13.

[6] Litwinczuk Z, Krol J, Brodziak A. et al. Change of protein content and its fractions in bovine milk from different breeds subject to somatic cell count[J]. J Dairy Sci, 2011, 94: 684-691.

[7] 金亞東等. 奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)對乳產(chǎn)量及乳成分的影響[J]. 中國乳品工業(yè), 2016, 44(6): 28-31.

[8] Pilla R, Malvisi M, Snel G G,etal. Differential cell count as an alternative method to diagnose dairy cow mastitis[J]. J Dairy Sci, 2013,96(3): 1653-1660.

[9] Sadeghi-sefidmazgi A, Moradi-shahrbabak M, Nejati-javaremi A, et al.Estimation of economic values and financial losses associated with clinical mastitis and somatic cell score in Holstein dairy cattle[J]. Animal,2011, 5(1): 33-42.

[10] 2016年終盤點(diǎn)中國乳業(yè)大事件回顧[J]. 中國乳業(yè), 2017. 181.2-12.

[11] 崔傳金等. 基于體細(xì)胞數(shù)的奶牛乳腺炎檢測方法研究進(jìn)展[J]. 中國乳品工業(yè), 2013, 41(7): 44-47.

[12] Kasikcl G, Cetin O, Bingol E B, et al. Relations between electrical conductivity, somatic cell count, California mastitis test and some quality parameters in the diagnosis of subclinical mastitis in dairy cows[J]. Turk J Vet Anim Sci, 2012, 36(1): 49-55.

[13] Patel P M, Bhat A, Markx G H. A comparative study of cell death using electrical capacitance measurements and dielectrophoresis[J].Enzyme Microbial Technology, 2008, 43(7): 523-530.

[14] 劉峰, 遲玉杰. 乳房炎乳的檢測方法[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2005,21(1): 129-131.

[15] Sierra D, Sanchez A, Luengo C, et al. Temperature effects on fossomatic cell counts in goat milk[J].Int Dairy J, 2006,16:385-387.

[16] 江樹鎮(zhèn)等. 生物芯片微通道的微細(xì)加工工藝[J]. 電加工與模具,2014, 3: 66-70.

[17] Cavero D, Tolle K H, Henze C, et al. Mastitis detection in dairy cows by application of networks[J]. Livestock Sci, 2008,114:280-286.

[18] Ankinakatte S, Norberg E, Lovendahl D, et al. Predicting mastitis in dairy cows using neural networks and generalized additive model:a comparison[J].Computers Electronics Agriculture, 2013, 99: 1-6.

[19] 崔傳金, 古少鵬, 左月明. 基于電參數(shù)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的奶牛乳腺炎檢測方法[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報, 2011, 42: 193-197.