超聲波檢測(cè)母牛卵巢后同步排卵的研究

編譯/伍佰鑫 雷 虹 張翠永 李劍波 宗占偉 易康樂

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

牛只的不孕會(huì)給養(yǎng)殖者造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，引起母牛不育的原因比較復(fù)雜，主要包括七大類：先天性不育、營(yíng)養(yǎng)性不育、管理不當(dāng)引起的不育、繁殖技術(shù)性不育、母牛衰老性不育、疾病性不育和免疫性不育。同期發(fā)情又稱同步發(fā)情（排卵），就是利用某些激素制劑人為控制并調(diào)整一群母畜發(fā)情周期的進(jìn)程，使之在預(yù)定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情（排卵），以便集中配種；同期發(fā)情（同期排卵）可解決牛群過于分散引起的人工授精不便等問題。超聲波是機(jī)械的壓力波，以人耳能聽到的聲波頻率為基準(zhǔn)，其頻率高于20 000 Hz；超聲波的頻率可高達(dá)1.0×1011Hz，測(cè)定頻率范圍一般在1～6 MHz，高頻顯示清楚但范圍較窄，低頻的清晰度中等但范圍較寬；超聲波的傳播要依靠彈性介質(zhì)，原理是將很短的電脈沖轉(zhuǎn)變?yōu)槌暡}沖，傳送到測(cè)定的介質(zhì)之中，脈沖遇到不同的組織層時(shí)，產(chǎn)生不同程度的聲衰減，返回至探頭，再轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖（回聲信號(hào)）呈現(xiàn)在屏幕上，根據(jù)傳送時(shí)間與回收時(shí)間的間隔，計(jì)算不同組織的厚度或長(zhǎng)度。在近20 年的時(shí)間里，超聲檢查設(shè)備的功能及質(zhì)量得到快速提升，設(shè)備的體積越來越小，攜帶越來越方便，使用越來越簡(jiǎn)單。

有些母牛發(fā)情癥狀不明顯，但體內(nèi)卻呈現(xiàn)正常的發(fā)情周期，容易被人忽視。對(duì)有黃體的母牛誘導(dǎo)發(fā)情的方法之一是，僅用PGF（前列腺素F2α）處理后就進(jìn)行人工輸精，發(fā)情癥狀需要仔細(xì)觀察，因?yàn)橐蕾囉诼雅荽笮〉陌l(fā)情時(shí)間變化很大，容易漏配。另外，（用手）直腸觸診到的黃體大小不準(zhǔn)確，不一定具備分泌卵泡的功能，也就不能誘導(dǎo)發(fā)情。PGF處理后，母?？赡艹尸F(xiàn)發(fā)情癥狀（例如爬跨），但難以把握適宜的輸精時(shí)間，導(dǎo)致受孕率低。同步排卵和定時(shí)輸精是解決母牛繁殖問題的重要方法。而運(yùn)用便攜式超聲波掃描儀評(píng)估母牛黃體及卵泡狀況，比直腸觸診法的判斷更加科學(xué)和準(zhǔn)確，對(duì)人工智能時(shí)代的奶牛和肉牛養(yǎng)殖者有重大的啟發(fā)和參考價(jià)值。

1 研究方法

從8 個(gè)不同地點(diǎn)牛場(chǎng)的1 272 頭母牛中隨機(jī)選擇578 頭母牛[年齡（5.5±3.1）歲；產(chǎn)犢后（84.0±48.3）天；胎次（4.3±3.0）胎；體況評(píng)分（3.15±0.40）分；超聲波檢查卵巢黃體直徑不小于18 mm；自由散養(yǎng)、自由飲水、1 天飼喂2 次干草和精飼料]。其中134 頭母牛作為A試驗(yàn)組，注射前列腺素F2α（簡(jiǎn)稱PGF）56 h之后，再注射促性腺釋放激素（簡(jiǎn)稱GnRH），16～20 h之后進(jìn)行定時(shí)人工輸精。另外138頭母牛作為對(duì)照-1組，（僅只）注射PGF之后，根據(jù)母牛發(fā)情狀況再輸精（每天觀察2 次；上午發(fā)情，下午輸；下午發(fā)情，次日上午輸）。由于A試驗(yàn)組和對(duì)照-1組的母牛飼養(yǎng)在一起，都在固定時(shí)間輸精，很可能會(huì)有一些輸精的母牛納入對(duì)照-1組統(tǒng)計(jì)分析而引起誤差，因此，還在其中的5 個(gè)牛場(chǎng)單獨(dú)選擇306 頭母牛作為對(duì)照-2組，這個(gè)組的母牛既不檢測(cè)卵巢黃體也不考慮排卵情況。在PGF處理時(shí)，A試驗(yàn)組和對(duì)照-1組母牛，使用肝素排空的采血管（日本），在母牛尾骨中部的靜脈采集血樣（10 mL/頭）；對(duì)照-2組母牛不采集血樣。血漿通過離心分離、-30 ℃保存直至激素水平分析結(jié)束。運(yùn)用小型視頻數(shù)字分析系統(tǒng)（mini-VIDAS）自動(dòng)熒光免疫檢驗(yàn)法（法國(guó)），酶聯(lián)熒光分析血漿孕酮濃度。

當(dāng)超聲波檢測(cè)到A試驗(yàn)組母牛卵巢黃體直徑達(dá)到或超過18 mm時(shí)，給母牛肌肉注射PGF（0.5 mg氯前列烯醇，日本）；56 h后再肌肉注射GnRH（100 μg醋酸發(fā)酵素，一種垂體激素釋放興奮藥，日本）；注射之后16～20 h之內(nèi)，進(jìn)行定時(shí)人工輸精。輸精24 h之后檢測(cè)其中的74 頭母牛以確認(rèn)排卵。對(duì)照-1組母牛注射PGF（未注射GnRH）之后的96～100 h之內(nèi)，其中72 頭無論是否發(fā)情或人工輸精，都檢測(cè)排卵情況，以便比較A試驗(yàn)組母牛的同步排卵。排卵的定義是GnRH處理2 天內(nèi)（或PGF處理后的96～100 h）卵巢中的大卵泡消失。

母牛激素處理后，6 臺(tái)便攜式超聲波掃描儀用于檢測(cè)卵泡參數(shù)（最大黃體和最大卵泡的直徑）、排卵狀況、輸精后30～50 天的妊娠診斷。所有超聲波掃描儀帶有7.5 MHz線性探頭，每2 臺(tái)超聲波掃描儀之間沒有測(cè)量誤差。卵泡直徑按2 mm間隔分類。

另外從上述8 個(gè)牛場(chǎng)中的4 個(gè)牛場(chǎng)隨機(jī)選擇38 頭母牛[年齡（6.7±3.4）歲；產(chǎn)犢后（73.3±39.2）天；胎次（4.9±3.1）胎；體況評(píng)分（2.9±0.3）分；超聲波檢查卵巢黃體直徑不小于18 mm、自由散養(yǎng)、自由飲水、1 天飼喂2 次干草和精飼料]作為B試驗(yàn)組，按A試驗(yàn)組操作步驟，先注射PGF；56 h后再注射GnRH；完后16～20 h之內(nèi)，進(jìn)行定時(shí)人工輸精。運(yùn)用帶有10.0 MHz線性探頭的超聲波掃描儀，通過直腸檢測(cè)生殖道，視頻記錄卵巢結(jié)構(gòu)（例如卵泡和黃體直徑、PGF處理時(shí)的黃體體積、GnRH處理時(shí)的黃體體積）。在實(shí)驗(yàn)室播放視頻，運(yùn)用動(dòng)態(tài)圖像軟件（美國(guó)）對(duì)卵巢進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，例如卵泡和黃體直徑、黃體體積（V）。在黃體兩面最外側(cè)，測(cè)量黃體的最大長(zhǎng)度（L）和橫向直徑（TD），按修正橢圓體形狀并根據(jù)下列等式估計(jì)黃體體積：V=0.523×L×TD× TD。

2 研究結(jié)果

黃體直徑不小于18 mm的母牛（272 頭），絕大多數(shù)[269頭；98.9%（269/272）]的孕酮濃度不小于1.0 ng/mL。PGF處理時(shí)，A試驗(yàn)組和對(duì)照-1組的孕酮濃度分別是（8.34 ±4.21）ng/mL和（7.34±4.20）ng/mL，兩個(gè)組無顯著差異。A試驗(yàn)組PGF處理時(shí)，卵泡最大直徑的大?。? mm間隔）對(duì)受精率無顯著影響。GnRH處理時(shí)，A試驗(yàn)組92%（124/134）的母牛、對(duì)照-1組87.7%（121/138）的母牛，最大卵泡直徑不小于9.0 mm；兩個(gè)組之間的占比（百分率）無顯著差異。A試驗(yàn)組GnRH處理時(shí)，卵泡最大直徑的大?。? mm間隔）對(duì)受精率無顯著影響；但存在正相關(guān)（P=0.609）；卵泡最大直徑不小于13 mm的母牛受孕率，趨向高于卵泡最大直徑12 mm的母牛受孕率（P=0.06）。

A試驗(yàn)組母牛同步排卵率[89.2%（66/74）]比對(duì)照-1組的[33.3%（24/72）]高，差異極顯著（P＜0.01）。A試驗(yàn)組母牛人工輸精受精率[100%（134/134）]高于對(duì)照-1組[87.0%（120/138）]和對(duì)照-2組[64.4%（197/306）]，差異極顯著（P＜0.01）；對(duì)照-1組又高于對(duì)照-2組，差異極顯著（P＜0.01）。對(duì)照-1組PGF處理時(shí)與人工輸精的間隔時(shí)間是（88.2±20.6）h。

A試驗(yàn)組、對(duì)照-1組和對(duì)照-2組母牛的受孕率分別是60.4%（81/134）、59.2%（71/120）和70.1%（138/197），3 個(gè)組之間差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)照-1組中，源于3 個(gè)牛場(chǎng)的母牛受孕率[50%（36/72）]，類似源于另外5 個(gè)牛場(chǎng)的母牛受孕率[53%（35/66）]。A試驗(yàn)組的母牛受孕率[60.4%（81/134）]，高于對(duì)照-2組的母牛受孕率[41.5%（138/306）]，差異顯著（P＜0.05）；趨向高于對(duì)照-1組的母牛受孕率[51.4%（71/138）]（P=0.08）。

PGF處理時(shí)，（后來）妊娠的母牛最大卵泡直徑[（10.0±0.05）mm]，類似于沒有妊娠的母牛最大卵泡直徑[（9.11±0.04）mm]（P=0.21）；（后來）妊娠的母牛的黃體直徑[（20.9 ±0.30）mm]顯著大于沒有妊娠的母牛的黃體直徑[（19.8 ±0.42）mm]（P＜0.05）；（后來）妊娠的母牛的黃體體積[（4.11±0.77）cm3]極顯著大于沒有妊娠的母牛的黃體體積[（3.24±0.80）cm3]（P＜0.01）。GnRH處理時(shí)，（后來）妊娠的母牛最大卵泡直徑[（12.4 ±0.04）mm]，顯著大于沒有妊娠的母牛最大卵泡直徑[（11.1±0.05）mm]（P＜0.05）。

3 討論

有報(bào)道稱，荷斯坦母牛卵巢黃體直徑不小于20 mm時(shí)，可分泌有功能作用的孕酮。本試驗(yàn)98.9%的母牛（黃體直徑不小于18 mm）的孕酮濃度不小于1.0 ng/mL（有功能作用），表明超聲波檢測(cè)可為黃體功能評(píng)價(jià)提供充分和客觀的方法。PGF（前列腺素F2α）處理時(shí)卵泡的最大直徑與（后來的）受孕率沒有顯著的聯(lián)系，可能原因是人工輸精不在同一地點(diǎn)或不是同一人操作、排出的卵泡并不總是最大直徑的卵泡。又據(jù)報(bào)道，GnRH（促性腺釋放激素）處理肉牛誘導(dǎo)排卵時(shí)，卵泡直徑不大于11 mm會(huì)降低受孕率、增加胚胎死亡或死胎率；本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GnRH處理時(shí)，卵泡直徑更大（不小于18 mm），受孕率更高，與此吻合。定時(shí)人工輸精后24 h內(nèi)的同步排卵率為89.2%（而不是100%），可能是牛的腦垂體對(duì)GnRH反應(yīng)減弱，導(dǎo)致黃體生成素（LH）釋放減少；排卵延遲、卵泡衰老，導(dǎo)致（后來的）受孕率降低。A試驗(yàn)組母牛人工輸精受精率為100%、2 個(gè)對(duì)照組的受精率分別是87.0%和64.4%，說明平常單靠肉眼觀察母牛發(fā)情后再輸精是不準(zhǔn)確的，而用超聲波檢測(cè)要準(zhǔn)確得多，因?yàn)槿斯ぽ斁珪r(shí)，有些母牛無黃體或無卵泡排出，也就不會(huì)受孕。

因此，便攜式超聲波掃描儀是檢測(cè)母牛卵巢黃體是否存在的實(shí)用工具，PGF處理時(shí)黃體的大小與（后來的）受孕率密切相關(guān)。當(dāng)檢測(cè)到母牛卵巢黃體直徑達(dá)到或超過18 mm時(shí)，給母牛肌肉注射PGF（0.5 mg氯前列烯醇---前列腺素F2α）；56 h后再肌肉注射GnRH（100 μg醋酸發(fā)酵素---促性腺釋放激素，一種垂體激素釋放興奮藥）；注射之后16～20 h之內(nèi)，進(jìn)行定時(shí)人工輸精，可實(shí)現(xiàn)同期發(fā)情、同步排卵、同期受精；提高受孕率和牛場(chǎng)生產(chǎn)管理水平。國(guó)內(nèi)已將便攜式超聲波掃描儀用于奶牛和肉牛的妊娠診斷，應(yīng)盡快應(yīng)用于母牛卵巢黃體檢測(cè)，實(shí)施同期排卵，提高人工授精的受孕率。