生長激素受體基因敲除小鼠模型

王小雙，米艾，孫捷，王丹，曾麗，冉麗媛*，吳英杰*

(1. 大連醫(yī)科大學重大疾病基因工程模式動物研究所，基因工程模式動物國際聯(lián)合研究中心，遼寧 大連 116044； 2. 吉林大學附屬第一醫(yī)院干部病房，長春 130000)

1966年，Zvi Laron首次發(fā)現(xiàn)一種常染色體隱性遺傳的侏儒癥并將其命名為Laron綜合征，該類患者身材矮小、青春期延遲、反復低血糖、低血清胰島素樣生長因子1(IGF-1)、高血清GH；進一步研究發(fā)現(xiàn)該疾病是由于GHR基因突變導致GH功能缺陷[1]。但受病例數(shù)量和科研手段限制，這種GH功能缺陷對機體生長代謝的長期影響及相關(guān)疾病治療與預后均未得到充分研究。

如今，基因編輯技術(shù)在研究疾病發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸治療等方面發(fā)揮日益重要的作用?？茖W家基于Cre/LoxP等技術(shù)建立了多種基因敲除模型以研究特定基因在特定組織或各種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。小鼠Ghr基因由15號染色體上共計10個外顯子編碼[2-3]，其中外顯子4編碼 GH結(jié)合區(qū)，因此也成為Ghr基因編輯的靶標。目前除了全身Ghr基因敲除小鼠外，肝、肌肉、脂肪等組織特異性Ghr基因敲除小鼠模型也逐步產(chǎn)生，用于分析GH相關(guān)信號通路在機體生長及代謝中的作用。

1 全身敲除Ghr基因小鼠模型

1997年Zhou等[4]構(gòu)建了第一只全身敲除Ghr基因小鼠模型(GHR-/-)，這是最早用于研究GH功能的實驗動物模型，迄今已發(fā)表相關(guān)論文70余篇。

GHR全身敲除對小鼠生長發(fā)育產(chǎn)生嚴重影響。GHR-/-小鼠生長緩慢，出生時體重與對照組無明顯差異，從3周齡開始，其身長、體重均小于對照組，且隨年齡增長差距越發(fā)明顯[4]。盡管雄性 GHR-/-小鼠體重較低，但其脂肪占比明顯增高，雌性GHR-/-小鼠無此現(xiàn)象[5-6]。隨年齡增加，GHR-/-小鼠(90周齡)體重有所降低[7]，這提示GHR-/-小鼠脂肪占比增加存在性別和年齡依賴。

由于缺少GH刺激和IGF-1負反饋調(diào)節(jié)，GHR-/-小鼠血清GH顯著增加，血清IGF-1含量減少[4]，血清瘦素[8]及脂聯(lián)素[9]水平均有升高。GHR-/-小鼠胰島素水平較低，但胰島素敏感性增加[5]，血膽固醇及低密度脂蛋白含量低[8]，壽命延長[10-11]。GHR-/-小鼠更容易被高脂飲食(High fat diet，HF)誘導產(chǎn)生肥胖，但胰島素敏感性仍優(yōu)于對照組[12]。這表明，當脂肪組織充分發(fā)揮儲脂功能時，肥胖對機體健康的損傷可能有所下降，也說明體內(nèi)脂質(zhì)含量不應(yīng)是衡量健康與否的核心標準。

與Laron綜合癥患者相似，GHR-/-小鼠性成熟較晚，生育能力降低[13-14]，平均每胎生仔2.71只，僅 GHR+/-小鼠的1/3(6.57只/胎)，且死亡率較高，這可能與胎盤功能和哺乳能力不足有關(guān)[4]。GHR-/-小鼠在生長發(fā)育、生殖及代謝方面的改變可為臨床探究GH功能失調(diào)相關(guān)疾病提供充足的理論依據(jù)。

2 肝特異性敲除Ghr基因小鼠模型

Fan等[15]在2009年構(gòu)建了一種GHR-Flox小鼠，并與Alb-Cre工具鼠雜交獲得肝特異性敲除ghr小鼠模型(GHRLD)。GHRLD小鼠血清IGF-1減少了95%，且伴隨嚴重高GH血癥(升高4倍)；但在幾乎完全缺失內(nèi)分泌 IGF-1的情況下，其身長體重并未受影響，僅出現(xiàn)肝重顯著增加而腎重減少。肝特異性敲除Igf-1也會導致高 GH血癥及血漿中IGF-1水平下降，但對小鼠生長并無顯著影響[16-18]，這說明肝源性 IGF-1并非小鼠生長所必需，循環(huán)中高水平GH與GHR的直接作用或機體其他組織通過自分泌、旁分泌產(chǎn)生的少量 IGF-1才是機體生長的關(guān)鍵。另外，GHRLD小鼠6周齡時即出現(xiàn)葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗(IR)，8周齡時自發(fā)形成脂肪肝[15]，說明肝GHR可能參與介導了GH非IGF-1依賴性的胰島素分泌及糖脂代謝調(diào)節(jié)。

2014年， List等[19]將 Alb-Cre工具鼠與其新構(gòu)建的 GHR-Flox小鼠雜交獲得新型肝特異性敲除Ghr小鼠模型(LiGHRKO)。與GHRLD小鼠不同，LiGHRKO小鼠脂肪減少，肝重增加，身長體重均明顯低于對照組。其中，雄性 LiGHRKO小鼠出現(xiàn)脂肪肝，而雌性小鼠肝無明顯變化。值得注意的是，在轉(zhuǎn)錄水平， LiGHRKO小鼠除了肝中Igf-1表達明顯降低外，其余組織中Igf-1表達均明顯升高[19]。由此可見，肝作為循環(huán)內(nèi)IGF-1的最大來源，其GHR缺失嚴重影響 GH依賴于 IGF-1的生長發(fā)育、血糖調(diào)節(jié)及肝脂質(zhì)代謝過程。非酒精性脂肪肝(NAFLD)作為代謝綜合征累及肝的病理表現(xiàn)，影響著全球三分之一的人群。據(jù)研究，GH受損人群NAFLD發(fā)病率更高[20]。循環(huán)水平低GH或肝GH/IGF-1軸功能受損均與 NAFLD發(fā)生相關(guān)。上述兩種模型為深入認識 NAFLD發(fā)病機制及其臨床個性化靶向治療提供了良好的實驗工具。

3 骨骼肌特異性敲除Ghr基因小鼠模型

Mavalli等[21]在2010年構(gòu)建了骨骼肌特異性敲除Ghr小鼠模型(ΔGHR)。骨骼肌Ghr缺失導致骨骼肌纖維比例顯著失調(diào)，Ⅰ型肌纖維明顯減少，Ⅱ型肌纖維明顯增多，骨骼肌肌核減少，肌力降低并產(chǎn)生胰島素抵抗[21]。同時，缺失Ghr的肌原細胞內(nèi)磷酸化的胰島素底物1表達上調(diào)，磷脂酰肌醇激酶及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化水平均顯著下調(diào)，這揭示了ΔGHR小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗的機制。

同肝Ghr敲除小鼠模型類似，肌肉敲除Ghr對小鼠生理代謝的影響也因Cre鼠的不同而各有差異。利用Mef-2c-73k-Cre構(gòu)建的ΔGHR小鼠脂肪增多導致體重增加，且產(chǎn)生高血糖和高血脂[21]；而利用 MCK-Cre構(gòu)建的mGHRKO小鼠則恰好相反，表現(xiàn)為消瘦、更優(yōu)的胰島素敏感性和糖耐量[22]。HF喂養(yǎng)后，mGHRKO小鼠脂肪肝病變較輕，胰島素敏感性較好，骨骼肌攝糖量及氧化呼吸率增加。HF處理的mGHRKO小鼠蛋白激酶 B磷酸化水平上調(diào)，這可能是其對胰島素更敏感的原因[22]。2015年， List等[23]利用 Ckmm-Cre鼠獲得新型骨骼肌和心肌特異性敲除Ghr小鼠模型(MuGHRKO)。研究發(fā)現(xiàn)雄性 MuGHRKO小鼠體重與脂肪重量均略有增加，血糖與血胰島素水平較低；而雌性MuGHRKO小鼠體重與脂肪組織重量則顯著減輕[23]。這與LiGHRKO小鼠肝脂肪變性僅限于雄性小鼠的發(fā)現(xiàn)類似[19]，提示Ghr基因在不同性別中的表達及GH在不同組織的功能發(fā)揮具有二態(tài)性，從而對GH的臨床研究及應(yīng)用起到一定指導作用。

4 脂肪特異性敲除Ghr基因小鼠模型

List等[24]在2013年利用aP2-Cre與 GHR-Flox小鼠雜交獲得脂肪特異性敲除Ghr基因小鼠模型(FaGHRKO)。FaGHRKO小鼠除了肥胖和脂肪明顯增多外，在血糖、胰島素、葡萄糖耐量、胰島素敏感性及脂肪細胞因子水平并無明顯改變。有研究報道Ap2基因不僅表達于脂肪組織，在非脂肪組織如心臟內(nèi)皮細胞、骨骼肌周圍毛細血管、巨噬細胞和胚胎發(fā)育過程中亦有表達[25]，這種非特異性表達可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。

脂肪組織不僅是機體重要的儲能和內(nèi)分泌器官，也是間充質(zhì)干細胞的最大來源，探索GH對脂肪的調(diào)控和脂肪源性干細胞增殖分化能力的影響可為臨床干細胞的體外培養(yǎng)和移植提供新思路。Adipoq-Cre是另一種在脂肪組織中特異表達 CRE酶的工具鼠。相較于ap2-Cre，其介導的基因重組更加特異[26]。利用Adipoq-Cre構(gòu)建新型脂肪特異性敲除Ghr小鼠模型，探索 GH相關(guān)信號通路對脂肪細胞分化、脂質(zhì)合成分解等代謝過程的調(diào)控及其與肥胖癥、脂肪肝等脂代謝紊亂疾病的關(guān)系是很有必要的。

5 巨噬細胞特異性敲除Ghr基因小鼠模型

肥胖常伴有脂肪組織中巨噬細胞(Mφ)的浸潤、積累和激活[27]。研究表明，在含有Mφ的條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)前脂肪細胞，其成脂分化能力更強，過氧化物酶體增殖物激活受體γ的轉(zhuǎn)錄水平升高，且Mφ這種促分化作用必須在 GH刺激下才能發(fā)生[28]。為了探索 GH對Mφ分泌因子的直接作用和對飲食誘導肥胖的影響，2010年 Lu等[29]將LysM-Cre鼠與Ghr-Flox小鼠雜交，獲得Mφ敲除Ghr小鼠模型(MacGhrKO)。 HF處理8周，MacGhrKO小鼠產(chǎn)生明顯的糖耐量異常， HF處理18周，MacGhrKO小鼠糖耐量損傷更明顯，并產(chǎn)生了胰島素抵抗。同時， MacGhrKO小鼠脂肪組織內(nèi)胰島素信號通路也被顯著抑制[29]。

Mφ在脂肪組織中有M1和M2兩種表型，其中M1數(shù)量增加與炎癥發(fā)生密切相關(guān)。在肥胖患者脂肪中存在大量Mφ浸潤并高表達M1標記物，分泌促炎細胞因子[30]。HF 處理18周后， MacGhrKO小鼠脂肪內(nèi) Mφ總數(shù)增加，M1比例升高且炎癥因子表達顯著增多。這表明在 HF條件下，Mφ缺失GH作用會導致脂肪組織中Mφ浸潤增加和明顯的炎癥反應(yīng)[29]。該模型證實GH參與肥胖與慢性炎癥的發(fā)生機制。

6 β細胞特異性敲除Ghr基因小鼠模型

2011年， Wu等[31]利用 RIP-Cre鼠構(gòu)建了β細胞特異性敲除Ghr基因小鼠模型(βGhrKO)。盡管Ghr全身敲除導致胰島細胞顯著變小[5]，但β細胞內(nèi)敲除Ghr后對小鼠胰島大小和胰島素含量并無明顯影響；HF處理24周后βGhrKO小鼠出現(xiàn)糖耐受不良及葡萄糖刺激的胰島素分泌不足，組織免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)其胰島細胞增殖明顯降低，這可能與細胞周期蛋白D2表達量降低有關(guān)[31]。

7 結(jié)語

GH相關(guān)信號通路在機體生長發(fā)育、糖脂代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[32-35]。上述多種Ghr基因敲除小鼠模型是深入研究GH生理病理功能的良好工具。臨床GH功能缺陷可發(fā)生于嬰幼兒、兒童直至成年期的不同階段，所引起或參與的代謝紊亂與發(fā)病年齡密切相關(guān)，導致的癥狀、對生長代謝的影響亦大不相同。不同時期發(fā)病的患者對環(huán)境及飲食因素的易感性也不盡相同[36]。兒童期 GH缺乏多由相關(guān)基因缺陷引起，如Laron綜合征，對機體生長發(fā)育影響重大；而成人階段GH功能紊亂隱匿且復雜，可與糖尿病、肥胖癥、肝疾病及其他激素紊亂互為因果，也可與藥物、創(chuàng)傷等外界因素相關(guān)[37]。因此，利用Ghr基因敲除小鼠模型解析GH對生長代謝的作用時，除了考慮組織特異性外，激素功能發(fā)生紊亂的時段特異性也尤為重要。

利用Cre-LoxP技術(shù)與時間特異性可誘導的基因敲除手段相結(jié)合，可使我們對體內(nèi)特定基因或基因組合的認識增加另一個維度。可誘導性基因敲除手段包括：他莫昔芬、四環(huán)素等配體誘導[38-39]；表達CRE的腺病毒或慢病毒載體注射進行體外傳送[40]、 RNAi介導[41]，以及由植物光感受器發(fā)展而來的光波誘導的蛋白質(zhì)相互控制[42]，從而達到DNA重組的目的。該類技術(shù)已在越來越多的全身或組織特異性基因敲除中得以實踐，如心臟[43-44]、腎[45]、腦[42]中特異性敲除基因等。已有報道成功構(gòu)建出他莫昔芬誘導的心臟特異性Ghr敲除小鼠模型(iC-GHRKO)[39]，以研究不同生長階段 GHR缺失的作用。故而開發(fā)可控、可逆轉(zhuǎn)的定時、定點、定系(細胞譜系)的Ghr敲除小鼠模型，無疑是未來深入探索 GH/GHR功能機制的必然方向。

另一方面，和許多其他激素相似， GH對生長發(fā)育和機體代謝的調(diào)控功能發(fā)揮具有脈沖式分泌、性別二態(tài)性和晝夜節(jié)律等特點，在對此類模型研究結(jié)果的解讀中不可忽視。另外，不同哺乳動物物種的代謝特征與其身體大小密切相關(guān)，因此，在對比基因敲除小鼠模型和臨床觀察結(jié)果時，有必要納入分析因素。