土撥鼠肝炎病毒感染模型在乙型肝炎研究中的應用

艾靈，朱彬，王俊忠，陸蒙吉，楊東亮，王寶菊*

(1. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院感染性疾病科，武漢 430022； 2. 德國Duisburg-Essen大學醫(yī)院病毒研究所，德國埃森 D-45122)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致的乙型病毒性肝炎是嚴重影響人民身體健康的傳染性疾病。全世界約有20億人曾感染HBV，其中至少2.4億患者為慢性HBV感染者，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，雖然乙肝疫苗計劃接種成功地將五歲以下幼兒的HBsAg攜帶率降至1%以下，但HBsAg的整體攜帶率仍高達7.18%，據(jù)此推算我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。雖然慢性乙型肝炎及其引發(fā)的肝衰竭、肝硬化、肝癌問題仍十分嚴重，但因其發(fā)病機制不明且現(xiàn)有的抗病毒藥物如干擾素和核苷類似物的治療效果不佳，乙型肝炎的防控形勢仍非常嚴峻。HBV相關科研機構及藥物研發(fā)企業(yè)仍在不斷探索以期找到更好的HBV防控藥物或生物制劑，而這些藥物、生物制劑以及一些聯(lián)合治療策略的臨床前評價均離不開合適的細胞和動物模型。HBV具有嚴格的種屬特異性，僅能感染人、黑猩猩和樹鼩，因此與HBV同屬嗜肝DNA病毒家族的土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus, WHV)以及鴨乙肝病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)感染的土撥鼠和鴨乙肝模型在乙型肝炎相關研究中應用廣泛[1]。本文主要綜述了WHV感染土撥鼠模型的免疫學特征，以及該模型在抗乙肝病毒藥物評價和免疫調節(jié)治療中的應用。

1 土撥鼠/旱獺WHV感染模型

WHV的發(fā)現(xiàn)可追溯到19世紀80年代，它在美國費城動物園患肝癌的東方土撥鼠(以下均簡稱土撥鼠)中首次被發(fā)現(xiàn)[2]。WHV與HBV同屬嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，兩者基因結構非常相似，并在核酸序列和氨基酸水平上具有高度同源性，其生物學特性和復制過程實際上是基本相同的[3]。此外土撥鼠WHV感染后的血清學和病理學特征類似于人類HBV感染，例如其血清中除檢測到完整病毒顆粒外，也可檢測到由WHV表面蛋白組成的桿狀和小球形顆粒[4]。不僅如此，WHV感染土撥鼠后的自然經(jīng)過也與人感染HBV高度類似。人HBV感染后的結局與感染時的年齡明顯相關，成人感染后僅5% ～10%發(fā)生慢性化，而90%的圍產期感染后發(fā)展為慢性感染。成年土撥鼠WHV感染后慢性化率低于5%，而幼年土撥鼠WHV感染的慢性化率可達60% ～75%[5]。此外，土撥鼠急性WHV感染被清除后，其肝臟內仍能檢出痕量的WHV DNA及殘存的炎癥反應，這可能是急性乙肝感染恢復后仍不能完全避免HCC發(fā)生的原因[6]。

東方土撥鼠(Eastern woodchuck)亦稱美洲土撥鼠(American woodchuck)，是Marmotamonax的俗稱，為松鼠科(Sciuridae)旱獺屬(Marmota)動物，亦可譯為美洲旱獺，分布在美洲大陸，引入國內非常困難，特別是WHV感染的土撥鼠，且價格高昂，在我國廣泛應用存在一定局限性。我國西北地區(qū)也有旱獺分布，主要有喜馬拉雅旱獺(Marmotahimalayana)、灰旱獺(Marmotabaibacina)和長尾旱獺(Marmotacaudata)等。我們研究發(fā)現(xiàn)喜馬拉雅旱獺(以下簡稱旱獺)對WHV高度易感，WHV感染后第2～4周血清中檢出WHsAg、WHV DNA，第4～6周檢出WHcAb，在第10周處死動物采集肝組織樣本，在肝內檢出HBV復制中間體、WHsAg和WHcAg，其感染經(jīng)過和成年土撥鼠WHV感染過程非常相似[7]。應用RNA-seq技術，我們比較了土撥鼠和旱獺轉錄序列同源性，結果發(fā)現(xiàn)74%的序列同源性高達90% ～100%，9.9%的序列同源性高達80% ～90%，7.67%的序列同源性高達60% ～70%，提示二者轉錄組序列高度同源[8]。因此在下文中我們將東方土撥鼠模型和喜馬拉雅旱獺模型統(tǒng)稱為土撥鼠模型。

2 土撥鼠WHV感染后的免疫學特征

越來越多的研究表明抗病毒藥物聯(lián)合免疫調節(jié)治療是實現(xiàn)慢性乙肝臨床治愈最有可能的方案。要將土撥鼠WHV感染模型用于免疫調節(jié)治療研究需首先建立土撥鼠免疫學研究手段，以便對該模型WHV感染后的免疫學特征進行研究。近年來，多種土撥鼠天然免疫、獲得性免疫分子被克隆，病毒特異性T細胞應答檢測方法的建立，大大促進了土撥鼠模型在乙肝免疫發(fā)病機制研究中的應用。

2.1 模式識別受體

模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)是病毒感染啟動天然免疫并介導獲得性免疫的重要分子。目前多種土撥鼠PRR已被成功克隆和進行功能分析，包括Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、干擾素γ誘導蛋白16(gamma-interferon-inducible protein 16, IFI16)、AIM-2(absent in melanoma 2)和維甲酸誘導基因I(retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)。我們的研究發(fā)現(xiàn)TLR2的配體可激活NF-κB、PI3K/Akt和部分MAPK信號通路，誘導肝細胞產生促炎細胞因子。TLR2配體刺激誘導的天然免疫應答可降低HepG2.2.15細胞中HBV與土撥鼠原代肝細胞中WHV的病毒復制和基因表達水平。土撥鼠WHV慢性感染時，外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)和肝組織中TLR2的表達水平相對較低，而急性感染或恩替卡韋經(jīng)治的慢性感染土撥鼠，其PBMC中TLR2表達水平與WHV DNA滴度呈負相關[9]。上述研究提示肝細胞在嗜肝DNA病毒感染TLR2介導的抗病毒應答中發(fā)揮重要作用，TLR2信號在急慢性WHV感染時的差異或許對慢性乙肝的免疫治療有參考價值。我們的研究也發(fā)現(xiàn)土撥鼠IFI16和AIM2在DNA介導的IFN-β和IL-1β的誘導中可能分別起關鍵作用；IFI16和AIM2轉錄物在急性WHV感染后肝臟和脾臟中上調，而IFI16在慢性感染后肝臟中下調，IFI16的配體VACV ds 70 mer體內轉染導致IFI16和IFN-β的上調，提示IFI16有可能作為HBV治療的新靶標[10]。

2.2 細胞因子及其受體

α干擾素(interferon α, IFN-α)被廣泛用于慢性乙肝的抗病毒治療，然而其應答率不高。近年來，關于土撥鼠IFN-α的認識越來越深入。有兩種亞型的土撥鼠IFN-α最早被發(fā)現(xiàn)，通過腺病毒載體將IFN-α基因導入來自WHV慢性感染土撥鼠的原代肝細胞內，可使肝細胞內WHsAg呈劑量依賴性降低[11]。隨后10個亞型的土撥鼠IFN-α和8個亞型的旱獺IFN-α被發(fā)現(xiàn)，二者具有非常高的同源性[12-13]。在Poly(I:C)刺激下，未感染W(wǎng)HV的土撥鼠PBMC可產生1、4、5型IFN-α，提示土撥鼠IFN-α亞型在PBMC呈選擇性表達；而慢性WHV感染土撥鼠PBMC的IFN-α產量減少，提示慢性HBV感染者的IFN應答受損。土撥鼠和旱獺1型干擾素受體(IFNAR1/2)序列已成功鑒定[14]。在IFNα/γ的刺激下，土撥鼠原代肝細胞IFNAR2的表達水平顯著升高，而慢性感染時IFNAR1和IFNAR2的表達水平則降低[15]。用重組的土撥鼠IFN-α治療慢性WHV感染土撥鼠15周后，通過RNA-seq 檢測肝內轉錄組學的改變，結果IFN-α誘導的抗病毒效應與肝內IFN刺激基因的表達沒有明顯相關性，而與肝內NK/T細胞的轉錄標志相關，提示IFN-α誘導的抗病毒效應更多地與NK/T細胞介導的細胞殺傷效應和非細胞殺傷效應相關[16]。

白介素10(interleukin 10, IL-10)是一種重要負向免疫調節(jié)分子，通過與其受體(IL-10R)結合發(fā)揮免疫抑制功效。土撥鼠的IL-10R已被克隆，并制備了其特異性多抗，該抗體能在體外使來自慢性WHV感染土撥鼠的病毒特異性T細胞的增殖和脫顆粒功能明顯增強[17]。

白介素12(interleukin 12, IL-12)在誘導抗病毒細胞免疫應答中發(fā)揮重要作用。研究表明肝內注射攜帶IL-12基因的腺病毒載體，僅能在低病毒載量的慢性WHV感染土撥鼠中發(fā)揮很好的抗病毒效應[18]。在高病毒載量動物體內不能很好地發(fā)揮抗病毒效應可能與TGF-β和Treg有關，在體外阻斷TGF-β和敲除Treg能恢復T細胞對IL-12的應答，然而在體內聯(lián)合TGF-β抑制性多肽和敲除Treg仍不能發(fā)揮很好的抗病毒效應[19]。

白介素15(interleukin 15, IL-15)在天然和獲得性免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要功能。我們克隆了土撥鼠和旱獺IL-15分子，并發(fā)現(xiàn)重組的IL-15蛋白能增強活化的小鼠脾細胞及土撥鼠PBMC增殖功能，慢性WHV感染土撥鼠肝臟內IL-15的表達輕度上調[20]。

2.3 T細胞應答

已有研究表明，病毒特異性的T細胞應答在HBV清除中發(fā)揮重要作用。T細胞表面標志是區(qū)分T細胞亞群的先決條件，且在T細胞功能分析中不可或缺。土撥鼠CD4、CD28、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、Tim-3、Galectin-9等T細胞表面標志均已克隆鑒定[21-26]。我們制備的抗土撥鼠CD4單克隆抗體(G2)在體外能有效抑制ConA誘導的淋巴細胞增殖，在健康土撥鼠體內能清除60% CD4+T細胞，余下的CD4+T細胞仍能保持對ConA刺激的反應性[23]。土撥鼠慢性WHV感染時CD8+T細胞上PD-1的表達水平明顯升高，且與WHV病毒載量呈正相關；恩替卡韋治療時，隨著病毒載量的下降，CD8+T細胞上PD-1表達水平隨之下降[25]。急慢性WHV感染時PBMC上PD-L1的表達均明顯上調，體外阻斷PD-L1 和PD-L2 能部分上調WHV感染土撥鼠PBMC的增殖和脫顆粒功能[26]。

檢測病毒特異性T細胞功能是將土撥鼠模型用于免疫發(fā)病機制和免疫調節(jié)治療的先決條件。最早建立的土撥鼠T細胞功能檢測方法是基于同位素氚[3H]標記的腺嘌呤的淋巴細胞增殖實驗，使用WHV抗原刺激土撥鼠PBMC后用液體閃爍計數(shù)儀檢測被細胞攝取的氚[3H]標記的腺嘌呤數(shù)量。應用上述方法，Menne等[27]發(fā)現(xiàn)WHV感染3周即可檢出強烈的針對WHsAg、WHcAg以及WHcAg 97-110aa多肽的T細胞應答，并在病毒清除期達到高峰。病毒清除1年后，病毒特異性T細胞應答僅能在WHV再次接種后檢出。新生土撥鼠接種WHV后，清除WHV的個體在急性期即可檢出強烈且多特異性的病毒特異性細胞免疫應答，而WHV持續(xù)感染的個體則缺如或應答不足[28]。隨著流式細胞術的發(fā)展，基于羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)的土撥鼠淋巴細胞增殖流式分析方法隨后也被建立[29]。CD107a可以作為細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)脫顆粒的標志，可被用于檢測抗原特異性的CTL應答[30]。應用建立的CD107a脫顆粒流式細胞技術，F(xiàn)rank等[31]發(fā)現(xiàn)：急性WHV感染的土撥鼠PBMC，用WHcAg 96-110aa多肽刺激后，從病毒復制的高峰期至感染后15周均能檢出強烈的CTL應答；而慢性WHV感染土撥鼠則不能檢出病毒特異性CTL應答。上述研究結果均與在人HBV感染及黑猩猩HBV感染中的T細胞應答高度近似。

3 土撥鼠WHV感染模型在抗病毒藥物評價中的應用

目前臨床上使用的核苷類似物包括拉米夫定(lamivudine, LAM)、阿德福韋酯(adefovir, ADV)、恩替卡韋和替諾福韋(tenofovir, TDF)均在土撥鼠模型進行了評價。以替諾福韋為例，土撥鼠分別按每日0.5、1.5或5.0 mg/kg的劑量用替諾福韋處理4周，血清WHV DNA水平均顯著降低，但血清WHcAb和WHsAb、肝內WHV RNA無顯著變化[32]。其中部分動物血清中WHsAg、肝內WHV復制中間體和肝內WHV抗原表達也出現(xiàn)一過性降低[32]。聯(lián)合抗病毒治療是HIV感染的標準治療方案，聯(lián)合抗病毒治療能否在HBV治療中取得更好的治療效果及其安全性在TDF上市之初就在土撥鼠模型中進行了評價。該研究發(fā)現(xiàn)ADV和LAM聯(lián)用、TDF和恩曲他濱(emdtricitabine, FTC)聯(lián)用24周，能顯著降低土撥鼠WHV病毒血癥水平，上述四種藥物單獨和聯(lián)用48周均未見明顯的生理、生化及血液學異常[33]。為驗證新藥在土撥鼠模型抗WHV療效能否預測該藥在慢性乙肝患者中抗HBV的療效，研究者在LAM上市之初就進行了下面的研究。四種當時已在臨床上使用的抗病毒藥物阿糖腺苷、病毒唑、LAM和泛昔洛韋在土撥鼠模型中抗WHV的療效與慢性乙肝患者抗HBV臨床研究中的療效類似，均可降低WHV病毒血癥和肝內WHV DNA復制水平[34]。和慢性乙肝患者的臨床研究結果類似，齊多夫定對WHV的復制無影響。這進一步說明WHV慢性感染的土撥鼠模型可以作為慢乙肝抗病毒治療藥物的精準研究模型。

除核苷類似物外，土撥鼠模型最近也被用于TLR7刺激劑GS-9620的臨床前研究[35]。研究發(fā)現(xiàn)GS-9620可快速、顯著且持續(xù)降低土撥鼠血清WHV DNA、肝內WHV DNA復制中間體、肝內WHV cccDNA和WHV RNA水平，使血清WHsAg水平低于檢測下限。GS-9620還可誘導部分土撥鼠對WHsAg產生持續(xù)的抗體應答，在持續(xù)低病毒載量的土撥鼠中顯著降低肝癌的發(fā)生率[35]。上述研究提示TLR7激動劑GS-9620的短期使用可誘導WHV慢性感染的土撥鼠產生持續(xù)的抗病毒應答，有可能在慢性乙肝患者中實現(xiàn)功能性治愈。

雖然土撥鼠模型在核苷類似物及TLR7激動劑中的研究結果能夠很好地預測這些藥物在慢性乙肝患者中的抗HBV療效，然而最近的研究也有不同發(fā)現(xiàn)。核酸聚合物(nucleic acid polymers, NAP)被發(fā)現(xiàn)可阻斷HBV感染肝細胞中HBsAg的釋放。NAP可清除DHBV感染時的血清DHBsAg，并顯著降低甚至清除人HBV慢性感染或HBV/HDV重疊感染時的HBsAg。雖然在土撥鼠和小鼠肝內均能檢出兩種NAP REP 2139和REP 2055的聚集，然而上述兩種NAP在WHV感染土撥鼠、HBV感染SCID-Hu小鼠及HBV轉基因小鼠中均未能檢出很好的抗WHV或抗HBV效應。推測可能是嚙齒類動物肝細胞中表面抗原顆粒的裝配及分泌不同于人HBV和鴨DHBV[36]。

4 土撥鼠WHV感染模型在免疫調節(jié)治療中的應用

病毒特異性的T細胞應答在HBV清除中發(fā)揮重要作用，其功能缺失是HBV感染持續(xù)的根本原因。核苷類似物治療只能暫時恢復HBV特異性的CTL功能[37]。與此類似，土撥鼠WHV慢性感染時，恩替卡韋治療也只能誘導短期的CTL應答[25]。因此抗病毒治療聯(lián)合免疫調節(jié)治療可能是實現(xiàn)慢性乙肝臨床治愈最有可能的方案。

表達WHV核心抗原的DNA疫苗初次免疫和腺病毒疫苗增強免疫在小鼠和土撥鼠中均能誘導強烈的CD8+T細胞應答。將其與恩替卡韋聯(lián)合使用后，可使WHV慢性感染的土撥鼠產生WHsAg 和WHcAg特異性CD4+和CD8+T細胞應答，且持久抑制WHV復制，維持低水平WHsAg。其中4只土撥鼠中有兩只在恩替卡韋停藥后仍維持WHsAg的血清學轉換[38]。上述研究結果提示抗病毒治療聯(lián)合DNA疫苗初次免疫-腺病毒疫苗增強免疫的新方案有可能成為慢性乙肝治療的新方案。

乙肝疫苗需冷鏈保存，在偏遠農村地區(qū)的普及難度較大，且乙肝疫苗仍存在血源性病原感染的風險。最近我們也在土撥鼠模型中評價了抗病毒藥物聯(lián)合疫苗免疫在HBV暴露后預防中的價值。我們發(fā)現(xiàn)恩替卡韋單藥或聯(lián)用DNA疫苗，可使土撥鼠在大劑量WHV接種后不出現(xiàn)病毒血癥，部分或全部動物產生了保護性免疫可以抵抗WHV的再次感染[39]?；谏鲜鲅芯浚覀兲岢龊塑疹愃莆飭为毷褂没蚵?lián)合乙肝疫苗可能是HBV暴露后預防的替代方案，特別是對發(fā)展中國家的偏遠農村地區(qū)居民、乙肝疫苗無應答者的職業(yè)或非職業(yè)HBV暴露后預防將大有裨益。

AIC649可直接作用于宿主免疫防御系統(tǒng)的抗原提呈細胞，調節(jié)細胞因子的釋放和活化T細胞的應答。AIC649對HBV轉基因小鼠可產生等同于替諾福韋的抗病毒效應。有趣的是AIC649治療在WHV慢性感染的土撥鼠產生雙向治療應答，WHV DNA和WHsAg在治療初期升高，隨后則顯著降低直至治療結束后，這可能與AIC649重建WHV特異性免疫應答相關[40]。

慢性病毒感染中PD-1/PD-L1的相互作用對T細胞功能耗竭至關重要，阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可部分恢復T細胞功能。慢性乙肝患者和慢性WHV感染土撥鼠中病毒特異性T細胞上的PD-1表達上調，體外阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可部分恢復T細胞功能。無論在慢性乙肝患者還是WHV慢性感染的土撥鼠，恩替卡韋治療均能降低PD-1的表達。因此抗病毒藥物聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷有可能較單用抗病毒藥物獲得更好的療效。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)：在自然感染所致的WHV慢性感染土撥鼠中，PD-L1抗體和恩替卡韋聯(lián)用比恩替卡韋單藥治療能更好地實現(xiàn)病毒血癥和WHsAg的控制，然而僅在少數(shù)土撥鼠中實現(xiàn)上述療效[41]。我們最近還測試了抗病毒藥物、DNA疫苗聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷的聯(lián)合免疫治療策略。我們發(fā)現(xiàn)PD-1抗體、DNA疫苗聯(lián)合恩替卡韋，可協(xié)同增強病毒特異性T細胞的功能，誘導部分土撥鼠實現(xiàn)病毒清除和WHsAg血清學轉換[25]。這些研究結果為慢性乙肝的免疫調節(jié)治療策略設計提供了新的可能。

總之，由于WHV和HBV在基因組結構、生物學特性、復制周期、感染后的自然經(jīng)過及免疫學特征均與HBV高度近似，因而土撥鼠WHV感染模型在抗病毒藥物評價方面有較高的應用價值，且已被廣泛應用。隨著該模型免疫學特征的闡明及免疫學檢測方法的完善，其在免疫調節(jié)治療策略及聯(lián)合治療策略評估中的應用價值也大大提高。得益于深度測序技術的進展，隨著土撥鼠模型轉錄組學數(shù)據(jù)的逐步豐富，該模型在生物醫(yī)藥中的應用也將進一步拓寬。然而，仍需注意到嚙齒動物和人、WHV和HBV尚存在一定的差異，因此在評價來自土撥鼠模型的研究結果時仍需謹慎。