CA15-3在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義

刁洪秀 ， 張 潤 ， 林德貴 ， 張 迪

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院 ， 北京海淀100193)

犬乳腺腫瘤(Canine mammary tumor, CMT)是未絕育母犬最常見的腫瘤之一，其中約有41%～53%的病例惡性程度較高，嚴(yán)重危及寵物的生命健康[1]。在獸醫(yī)臨床中，乳腺腫瘤的診斷包括臨床癥狀檢查、X射線檢查、組織病理學(xué)檢查等，但對早期乳腺癌診斷價(jià)值有限。乳腺癌病因尚不確定，且早期癥狀不明顯，因此，早診斷、早治療是預(yù)防乳腺癌的有效手段。糖鏈抗原15-3(CA15-3)是一種高糖基化跨膜蛋白，在多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，其胞外結(jié)構(gòu)域在某些因素的刺激下會(huì)脫落進(jìn)入血液循環(huán)，現(xiàn)已成為人醫(yī)臨床乳腺癌診斷和監(jiān)測的生物標(biāo)志物之一[2]，但在獸醫(yī)臨床上尚未見報(bào)道。因此，本研究以CA15-3為研究對象，檢測其在健康犬和乳腺腫瘤患犬的組織和血清中是否存在差異，分析其在犬乳腺腫瘤中的作用和臨床意義，為小動(dòng)物乳腺腫瘤的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本 所有樣本均來自于2014年到2015年期間來本校動(dòng)物醫(yī)院就診的病例。共收集乳腺腫瘤病例40例(10.26±2.5歲)，參照WHO發(fā)布的CMT國際組織學(xué)分級和Goldschmidt等[3，4]在2011年提出的CMT分類和分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類，即實(shí)體癌7例、混合癌6例、單純?nèi)橄傩」馨?例、單純?nèi)轭^小管狀癌3例、簡單腺癌1例、癌肉瘤1例、惡性肌上皮瘤1例、腺鱗癌1例、混合腺瘤8例、良性混合瘤3例、腺瘤2例以及增生2例。健康犬33例(7.65±3.9歲)，所有犬均為雌性。

1.2 主要試驗(yàn)試劑和儀器 CA15-3 ELISA試劑盒，購自Biocheck公司；CA15-3單克隆抗體，購自Novus公司；SP-9002生物素-鏈霉卵白素免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀、切片機(jī)、組織包埋機(jī)、烤片機(jī)、光學(xué)顯微鏡等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血清中CA15-3的檢測 犬后肢隱靜脈采血2 mL，促凝管中靜置10 min，2 500 r/min離心10 min，取上清于1.5 mL EP管中，參照CA15-3 ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.2 組織中CA15-3的檢測 石蠟切片經(jīng)過脫水、抗原修復(fù)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色等過程進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)檢測。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：CA15-3蛋白陽性信號(hào)主要集中在腺泡上皮和導(dǎo)管上皮頂膜和胞漿中，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性染色。對每個(gè)IHC樣本隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image Pro Plus對照片平均光密度值進(jìn)行分析。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 犬血清中 CA15-3含量的檢測結(jié)果 犬血清樣本中CA15-3濃度及其與臨床病理因素的關(guān)系見表1。由表1可知，健康犬和乳腺腫瘤患犬血清中CA15-3濃度分別為5.72 U/mL±4.82 U/mL、15.70 U/mL±12.93 U/mL，兩者之間差異顯著(P<0.05)。乳腺腫瘤患犬中，血清中CA15-3濃度在不同年齡、不同病理類型和不同組織分級中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。經(jīng)病例回訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好和死亡的病例中，CA15-3濃度依次為12.49 U/mL± 8.04 U/mL, 22.84 U/mL±11.12 U/mL，兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 乳腺腫瘤患犬血清CA15-3水平與臨床病理因素的關(guān)系

注：同一病理因素，數(shù)據(jù)肩頭字母不同表示差異顯著，P<0.05

2.2 犬乳腺組織中CA15 -3蛋白的表達(dá) 乳腺組織中CA15-3 部分IHC結(jié)果及其與臨床病理因素的關(guān)系，見中插彩版圖1和表2。正常乳腺組織中，CA15-3在乳腺上皮細(xì)胞中呈低表達(dá)。在乳腺腫瘤組織中，幾乎所有樣本均呈現(xiàn)中度到強(qiáng)陽性表達(dá)，胞漿和胞核著色較深，染色區(qū)域呈彌散狀或顆粒狀。使用Image Pro Plus軟件計(jì)算所有樣品的平均光密度(MOD)發(fā)現(xiàn)，CA15-3 MOD在乳腺腫瘤組織中要明顯高于健康犬乳腺組織(P=0.008)，I 級、II 級、III 級腫瘤組織中，CA15-3 MOD值均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在不同年齡和不同病理分型中，CA15-3 MOD值不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。經(jīng)病例回訪發(fā)現(xiàn)，不同預(yù)后結(jié)果之間，組織 CA15 -3蛋白表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論

在人醫(yī)臨床上，腫瘤生物標(biāo)志物的檢測已成為繼影像學(xué)診斷和組織病理學(xué)診斷之后, 臨床最常用的腫瘤診斷方法之一。CA15-3是乳腺的相關(guān)抗原，存在于多種腺癌細(xì)胞內(nèi)，是診斷乳腺癌較特異的標(biāo)志物[5]。美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)于2007年將CA15-3推薦為乳腺癌預(yù)防、診斷及隨訪的重要腫瘤標(biāo)志物之一[6]，但在獸醫(yī)臨床上鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)中，40例乳腺腫瘤患犬血清中CA15-3濃度要明顯高于健康犬，盡管乳腺腫瘤患犬血清CA15-3 濃度在不同病理類型和組織分級中不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在惡性腫瘤中其平均濃度上升了59.38%，且隨著組織分級的加劇，其含量不斷升高，說明CA15-3 同樣適用于犬乳腺腫瘤的診斷。在預(yù)后回訪中發(fā)現(xiàn)，死亡病例血清中CA15-3濃度要遠(yuǎn)高于預(yù)后良好的動(dòng)物，說明血清CA15-3與犬乳腺腫瘤的預(yù)后有關(guān)。另外，在乳腺組織CA15-3 IHC結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，CA15-3在乳腺腫瘤中的陽性檢出率幾乎是100%，且胞漿、胞膜和胞核呈中度到強(qiáng)陽性表達(dá)。以往的研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，腫瘤組織中CA15-3主要呈胞漿內(nèi)過表達(dá)，但也有文獻(xiàn)說[9]，在細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，CA15-3的胞內(nèi)部分可能會(huì)脫落至細(xì)胞核，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。乳腺腫瘤組織中CA15-3 MOD值與病理分級密切相關(guān)，隨著組織學(xué)分級的加劇明顯上調(diào)，這與血清中CA15-3的結(jié)果相一致，說明組織中CA15-3的表達(dá)與犬乳腺腫瘤組織學(xué)分級具有明顯的相關(guān)性。

表2 組織中CA15-3與犬乳腺腫瘤臨床病理因素的關(guān)系

注：同一病理因素，數(shù)據(jù)肩頭字母不同表示差異顯著，P<0.05

4 結(jié)論

血清CA15-3可以作為犬乳腺腫瘤早期診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物之一，組織中CA15-3的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級密切相關(guān)，可作為評估犬乳腺腫瘤惡性程度的生物標(biāo)志物之一。