2，4-噻唑烷二酮改善奶山羊?qū)﹄[性乳房炎先天免疫力的研究

編譯/伍佰鑫 雷 虹 何 芳 李 晟 王 慧

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

乳房炎是乳房感染（通常是細(xì)菌）的炎癥反應(yīng)，對動物福利、生鮮乳的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生不利的影響。為了增強奶山羊自身對隱性乳房炎的抵抗能力，美國和意大利的學(xué)者用2，4-噻唑烷二酮和鏈球菌對泌乳奶山羊進行科學(xué)試驗，其研究方法、結(jié)果和結(jié)論值得中國奶山羊養(yǎng)殖者借鑒。

1 試驗方法

從美國俄勒岡州圖馬洛山羊場采購24 頭莎能奶山羊，年齡（5.1±0.6）歲、胎次（3.6±0.6）胎、泌乳天數(shù)（156±14）天、體重（68.1±7.6 ）kg、按1～5 分的體況評分標(biāo)準(zhǔn)為（1.6±0.5）分，生鮮乳的細(xì)菌分析為陰性。奶山羊隨機分為4 組，每組1 個羊欄，每欄6 頭。每天飼喂2 次精飼料（08:00和18:00），自由采食干草（大約50%的果園干草和50%的苜蓿干草）；擠奶期間添加150 g山羊精飼料。每天（08:00）用移動式擠奶機給奶山羊擠奶1 次，擠奶前后用0.5%碘酒浸洗乳頭。

1.1 2，4-噻唑烷二酮處理

奶山羊在新環(huán)境適應(yīng)1 周之后，安裝帶有延伸裝置的頸靜脈留置導(dǎo)管（少數(shù)在試驗期間掉落，直接進行頸靜脈注射），每天用10 mL肝素化生理鹽水（2 IU/mL）沖洗2 次，用彈力繃帶固定和隱藏，1 周后再更換成獸用繃帶。在導(dǎo)管插入當(dāng)天，12 頭奶山羊（A組）每天12:00每頭注射2，4-噻唑烷二酮8 mg/kg體重（溶于10 mL無菌生理鹽水），此劑量是以前用于奶牛試驗的2 倍；另外12 頭奶山羊（B組）每天12:00每只注射10 mL生理鹽水，試驗期共20 天。

1.2 乳房炎處理組

試驗1 周、上午擠奶之后，每組半數(shù)的奶山羊（A1組6 頭、B1組6 頭）每頭每個乳房內(nèi)（借助1 次性無菌導(dǎo)管）注入含有1.7 × 108個鏈球菌的10 mL無菌生理鹽水，作為乳房炎試驗組；剩余的（A2組6 頭、B2組6 頭）奶山羊每頭每個乳房內(nèi)只注入10 mL無菌生理鹽水，作為乳房炎試驗的對照組。注入時用濕毛巾清潔乳頭末端，然后用70%酒精棉擦拭消毒。注入后向上充分按摩乳房大約20 s以便接種均勻。試驗用的鏈球菌來源于1.5 mL無菌瓶（從1 頭乳房炎母牛體內(nèi)分離、用DNA技術(shù)確定細(xì)菌品系）。乳房注射后，A1組有2 頭奶山羊體溫超過41 ℃并停止產(chǎn)奶，終止試驗，因此2，4-噻唑烷二酮乳房炎試驗組只有4 頭奶山羊。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)和體細(xì)胞數(shù)分析

采購奶山羊當(dāng)天、乳房注入前3 天、進行乳房注入前（共3 次）均要采集奶樣進行細(xì)菌分析。每次采樣前，乳頭均要進行碘酒浸洗、一次性紙巾擦干，乳頭孔用70%酒精消毒，并丟棄首先擠出的奶，將大約1 mL奶樣采集至1.5 mL無菌管中。所有樣本立即覆蓋冰塊，在4 h內(nèi)轉(zhuǎn)移到實驗室，進行血瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)。所有樣本中（試驗用的）的鏈球菌均呈陰性。對即將進行乳房注入之前的奶樣進行體細(xì)胞數(shù)分析。

1.4 產(chǎn)奶量和乳成分分析

試驗期每天記錄產(chǎn)奶量。在奶山羊分組（分欄）前5 天、準(zhǔn)備注射2，4-噻唑烷二酮的當(dāng)天、注射乳房鏈球菌的當(dāng)天、注射乳房后的第1、2、3、5、7、12天，用10 mL小瓶采集奶樣，分析乳成分（體細(xì)胞數(shù)、乳糖、乳脂、乳蛋白）。用計算式[0.327×產(chǎn)奶量（kg）+12.95×脂肪量（kg）+7.65×蛋白質(zhì)量（kg））]計算能量校正乳。

1.5 體溫與稱重

在注射乳房前、后的最初6 h中的每個小時、注射乳房后6～114 h內(nèi)每個間隔大約8 h，用直腸溫度計檢測奶山羊的體溫。試驗期內(nèi)奶山羊每周稱重1 次并記錄。

1.6 采血

在注射2，4-噻唑烷二酮的當(dāng)天、注射鏈球菌前的2 天、注射鏈球菌后最初3 天的每一天（24 h、48 h、72 h）、注射鏈球菌后第6天和第12天，奶山羊上午飼喂前，用內(nèi)含抗血凝劑（或肝素鈉）的10 mL真空管和20號針頭，從頸靜脈采集血液樣本。采集完畢后，內(nèi)含肝素鈉的樣本管覆蓋冰塊，內(nèi)含抗血凝劑的樣本管室溫保存（30 min），離心機離心，-20 ℃保存直至分析結(jié)束。

1.7 血液代謝產(chǎn)物與炎癥標(biāo)識

血漿和血清樣品用冰塊保護以分析以下參數(shù)，包括糖代謝參數(shù)、膽固醇、尿素（脲）、鈣、鎂、游離脂肪酸（NEFA）、三酰甘油（TG）、β-羥基丁酸（β-HBA）和視黃醇（維生素A）；炎癥相關(guān)的參數(shù)包括白蛋白、親血色球蛋白（結(jié)合珠蛋白）、血漿銅藍(lán)蛋白、對氧磷酶、髓過氧物酶（綠過氧物酶）、總膽紅素、總活性氧代謝產(chǎn)物（ROMt）、鋅和α-生育酚（維生素E）；肝臟參數(shù)是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γGT）。

1.8 胰島素分析

在注射2，4-噻唑烷二酮5 天后、注射鏈球菌3 天后，用商業(yè)性酶聯(lián)免疫吸附測定套件（ELISA）檢測胰島素的濃度。胰島素敏感性定量檢查指數(shù)=1÷（log空腹血胰島素μU/mL +log空腹葡萄糖mg/dL），校正的胰島素敏感性定量檢查指數(shù)=1÷（log空腹血胰島素μ U/m L+l o g空腹葡萄糖mg/dL+log游離脂肪酸mmol/L）。

1.9 吞噬百分率測定

在鏈球菌注射前2 天和后1天，用一半數(shù)量的噬菌細(xì)胞檢測試劑（德國），從100 μL肝素抗凝全血中分離白細(xì)胞的噬菌細(xì)胞容量，使用每個試劑一半的數(shù)量減少大約5%的吞噬作用。給DNA染色的有核細(xì)胞裝上門控后，運用側(cè)向散射和前向散射評定多形核白細(xì)胞PMN（或粒性白血球）的百分率，確定所有白細(xì)胞、PMN和單核細(xì)胞的吞噬百分率。

1.10 脂肪活檢

在鏈球菌注射前1 天和后7天，通過活組織檢查，在尾頭交替?zhèn)炔杉は轮窘M織。將剪斷的尾頭區(qū)域充分擦洗干凈，在切口區(qū)皮下注射2%利多卡因。用無菌鉗和外科手術(shù)刀做4～5 cm切口，暴露并采集組織，然后縫合。將活組織放入無菌培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)皿里有噴灑過核糖核酸酶的紗布，用無菌手術(shù)刀解剖結(jié)締組織和大血管，借助一次性無菌注射器和無菌生理鹽水洗滌組織，洗干凈的組織切成3份，其中2 份放入2 mL離心管中，再放入有干冰的泡沫盒，送到實驗室-80 ℃保存。另外1 份放入1.5 mL離心管中，內(nèi)含10%中性緩沖液福爾馬林，此份用于組織學(xué)分析。

1.11 乳腺上皮細(xì)胞分離

運用磁力分選，從50 mL羊奶中分離乳腺上皮細(xì)胞。奶樣采集到50 mL無菌管中，立即放置冰塊保存。大約1 h后，4 ℃離心（1 000×g）10 min以分離脂肪和顆粒細(xì)胞。細(xì)胞用10 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2 次，4℃離心（500×g）5 min，細(xì)胞第2次洗滌前用小型自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。最后將顆粒重懸在500 μL的PBS和0.1%牛血清蛋白溶液中，再轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管（用PBS和0.1%牛血清蛋白溶液預(yù)濕潤）中，添加與皮爾斯（Pierce）蛋白銀磁珠結(jié)合的上皮特異性標(biāo)記黏液素抗體（1 μL有1.0×106個細(xì)胞）。樣本在1 個搖動器里的冰塊上培養(yǎng)30 min，細(xì)胞用PBS洗滌1 次，立即用自動分離器分離。分離的陽性和陰性細(xì)胞-80 ℃保存，直至提取核糖核酸（RNA）。對于5 個隨機奶樣，先測定酪蛋白κ表達(dá)和抗體陽性陰性細(xì)胞上的乳白蛋白，再在5 個陽性細(xì)胞和5 個陰性細(xì)胞上，進行乳腺上皮細(xì)胞富集的評價。總的來看，抗體顯示有更多的乳腺特異基因酪蛋白k和（乳白蛋白+抗體）。

1.12 RNA分離和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

用核糖核酸（RNA）清洗與集中器提取RNA。先用高速攪拌機破碎脂肪組織，分光光度計給脂肪組織的RNA定量，生物分析儀器評定RNA的完整度是（4.0±2.0），變動幅度為1.0～9.0。在（美國）國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）搜索山羊的特異序列。檢測了6 個潛在的內(nèi)部控制基因，即3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、核糖體蛋白S9、酪氨酸3-單加氧酶、色氨酸5-單加氧酶激活蛋白多肽、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、線粒體核糖體蛋白L39。運用除開線粒體核糖體蛋白L39之外的5 個內(nèi)部控制基因，獲得脂肪組織最可靠的歸一化因子（V值=0.23）。鑒于靶轉(zhuǎn)錄與脂質(zhì)合成有關(guān)、過氧化物酶體增生物γ 激活和炎癥有關(guān)，因此測定了過氧化物酶體增生物γ的豐度、假定靶脂蛋白脂酶、脂肪酸合成酶。同時也測定了乙酰輔酶A羧化酶α的轉(zhuǎn)錄、固醇（甾酮）調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤壞死因子α，還測定了抗體、白細(xì)胞介素8和趨化因子配體2。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件如下：50 ℃、2 min；95 ℃、10 min；60 ℃、1 min后40 個循環(huán)的95 ℃、15 s。執(zhí)行解離曲線（從60 ℃到95 ℃的梯度）檢查擴增子質(zhì)量，最終數(shù)據(jù)通過2 倍稀釋的6 個點標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。

1.13 脂肪組織學(xué)分析

保存在10%福爾馬林中性緩沖液中的脂肪組織樣本，浸入15%蔗糖磷酸鹽緩沖溶液，再浸入30%蔗糖磷酸鹽緩沖溶液，在-27 ℃切成15 μm的碎塊。碎塊用水漂洗30 s后在磷酸鹽緩沖溶液中洗滌，然后在哈里斯蘇木精溶液培養(yǎng)3 min，再用溫水漂洗25 s，浸泡在曙紅溶液中，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗1 min，在80%乙醇中洗滌1 min，最后浸入二甲苯10 s，置于載玻片上，在顯微鏡（10×）里成像。用CellProfiler 2.1.1軟件分析脂肪細(xì)胞的大小。除測定脂肪細(xì)胞平均面積外，再測定脂肪細(xì)胞不同部位和直徑的頻率，以便估計新脂肪細(xì)胞（小尺寸）和大脂肪細(xì)胞的形成 。

2 研究結(jié)果

乳房注射后最初5 h內(nèi)，所有處理組的奶山羊體溫總體下降，但在緊接著的39 h（即第6h至第44h）內(nèi)顯著升高，尤其是鏈球菌處理組（A1和B1）。與其它組相比，未注射2，4-噻唑烷二酮但注射了鏈球菌的處理組（B1）趨向于維持更高的體溫，直至注射后114 h（大約5 天）達(dá)到一個顯著的較高值（40.6 ℃）。與其它組相比，注射2，4-噻唑烷二酮但沒有注射鏈球菌的處理組（A2）有更加穩(wěn)定和更低的體溫。奶山羊體重不受任何處理的影響。

2.1 產(chǎn)奶量和乳成分

鏈球菌處理組（A1和B1）的體細(xì)胞數(shù)總體上顯著高于其它組，但在注射之前無差異。在鏈球菌注射的前1 天和后2 天，A1和B1組的體細(xì)胞數(shù)增加的倍數(shù)（分別是13.9倍和11.3 倍）比A2和B2組增加的倍數(shù)（分別是1 倍和1.3 倍）多，差異顯著。A1和B1組維持比其它2 個組較高的體細(xì)胞數(shù)直至試驗結(jié)束。接受2，4-噻唑烷二酮注射的奶山羊，尤其是注射后最初2天期間的A2組（注射2，4-噻唑烷二酮但未注射鏈球菌）奶山羊，體細(xì)胞數(shù)總體上較低。盡管在第8天觀察到顯著的差異，但校正數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，未注射2，4-噻唑烷二酮但注射鏈球菌的處理組（B1）體細(xì)胞數(shù)總體上比其它3 個組高。說明未注射2，4-噻唑烷二酮的奶山羊一旦感染細(xì)菌，體細(xì)胞數(shù)就會迅速升高。

試驗?zāi)躺窖虻幕€產(chǎn)奶量是（1.12±0.35） 千克/天。鏈球菌處理組（A1和B1）的產(chǎn)奶量總體下降，A1組只有一只產(chǎn)奶量數(shù)值下降，但B1組所有羊只產(chǎn)奶量數(shù)值都下降。鏈球菌處理組（A1和B1）的乳蛋白率較高，可能是較高的體細(xì)胞數(shù)導(dǎo)致。2，4-噻唑烷二酮處理組（A1和A2）的乳糖率較高。雖然統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著，但未注射2，4-噻唑烷二酮但注射鏈球菌的處理組（B1）乳脂量數(shù)值較低。B1組的能量校正奶下降。其它乳成分參數(shù)不受影響。

2.2 血液代謝參數(shù)

葡萄糖濃度不受2，4-噻唑烷二酮的影響，但鏈球菌注射后葡萄糖濃度總體上較高（主要是由于B1組血糖濃度的大量增加），相反，A1組的葡萄糖濃度與A2和B2組相比無顯著差異。除A2組外，其它組的游離脂肪酸總體上增加。與2，4-噻唑烷二酮處理組（A1、A2）相比，其它組（B1、B2）的游離脂肪酸濃度更加持續(xù)性增加，2，4-噻唑烷二酮處理組（A1、A2）的游離脂肪酸濃度總體上趨向更低。乳房注射后所有組的β-羥基丁酸濃度下降；乳房注射后的第12天，2，4-噻唑烷二酮處理組的β-羥基丁酸值總體上更低。三酰甘油的濃度不受影響，但鏈球菌處理組趨向更高（P=0.06）。乳房注射后第1天、第6天和第12天，A1組的尿素（脲）濃度比其它組高（P=0.09）。乳房注射后所有組的α-生育酚（維生素E）濃度都顯著下降，但組與組之間無顯著差異。2，4-噻唑烷二酮處理對血漿胰島素水平和胰島素敏感性定量檢查指數(shù)無顯著影響。

2.3 血液礦物質(zhì)

A1和B1組鏈球菌注射前的鈣增加，注射之后趨向于維持更高水平（主要因為A1組有更高濃度的鈣）。A1和B1組的鋅濃度趨向于比其它組的高（P=0.08），鏈球菌注射后總體上前期的比后期高；離注射前還有2 天和注射后第6天，A1組的鋅濃度比其它組高；注射后第12天，A2組的鋅濃度較高。注射后鎂的水平下降，但組與組之間無顯著差異。

2.4 炎癥與肝臟應(yīng)激

乳房注射前7 天內(nèi)，陽性急性期結(jié)合珠蛋白+APP（多聚磷酸銨）的水平是（0.30±0.25） g/L；2，4-噻唑烷二酮處理1 周后，該蛋白水平總體上比B2組低，差異顯著。鏈球菌注射后，所有組的結(jié)合珠蛋白水平快速上升（＞2 g/L），但A1、B1組總體上是持續(xù)更高水平（主要因為B1組）。所有組的血漿銅藍(lán)蛋白，隨著鏈球菌注射時間的推移而增加，A1、A2組對此無顯著影響；但在試驗結(jié)束時，A1、A2組比B2組的數(shù)值更低。

在標(biāo)識上，2，4-噻唑烷二酮處理1 周后，A1和A2組的髓過氧化物酶（中性粒細(xì)胞吞噬力）總體上低于B2組，但鏈球菌注射后顯著增加，一直到試驗結(jié)束都比B2組的高；A2組的髓過氧物酶總體上比其它組高。鏈球菌注射前，組與組之間的肝臟應(yīng)激參數(shù)γGT（γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶）含量沒有差異，但注射后A1和A2組總體上比B2組高（主要因為鏈球菌注射后第6天A2組的γGT含量增加）。

在陰性急性期反應(yīng)指標(biāo)之間，只有A1和A2組的白蛋白隨時間變得更高。B1和B2組的總膽固醇含量下降，在鏈球菌處理后第6天顯著低于A1和A2組。鏈球菌注射前2 天，A1組的視黃醇（維生素A）較高；在注射后第6天，B1組的視黃醇較低。在鏈球菌處理后，作為肝臟清除能力指數(shù)的陰性急性期蛋白、抗氧化劑對氧磷酶和總膽紅素的活性都減少，不受2，4-噻唑烷二酮的影響。鏈球菌處理后，所有處理組總的活性氧代謝物增加，不受2，4-噻唑烷二酮的影響。

2.5 血液中的多形核白細(xì)胞和吞噬作用

乳房注射前，血液中的多形核白細(xì)胞百分率是（62.5±1.7）%，組與組之間無顯著差異。乳房注射后，所有組的多形核白細(xì)胞濃度（%）都降低，鏈球菌處理組（A1和B1）的多形核白細(xì)胞濃度（%）比B2組（既沒有2，4-噻唑烷二酮，又沒有鏈球菌）的下降幅度大。所有粒性白細(xì)胞和多形核白細(xì)胞的吞噬作用（%）只受時間影響，不受2，4-噻唑烷二酮或鏈球菌的影響；單核細(xì)胞吞噬作用因鏈球菌注射而減少。

2.6 基因表達(dá)

乳房注射后，A1組的基因表達(dá)量總體上比其它組增加。鏈球菌處理顯著影響?zhàn)さ鞍祝股掀ぬ禺愋詷?biāo)志物的抗體）的基因表達(dá)，在鏈球菌注射后第1天較低；在第7天，A1和A2組的基因表達(dá)量比B2組高。鏈球菌誘導(dǎo)顯著增加了CCL2的表達(dá)（CCL2是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的化學(xué)引誘物）。PPARγ（過氧化物酶體增生物激活受體γ）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和它的靶基因都隨時間增加或趨向于增加，2，4-噻唑烷二酮處理組的過氧化物酶體增生物激活受體的轉(zhuǎn)錄表達(dá)趨向于更高（P=0.08），尤其是在鏈球菌注射后的第1天。

2.7 脂肪細(xì)胞大小

脂肪細(xì)胞平均面積隨時間顯著增加（主要因為A2組）。鏈球菌處理前1天，2，4-噻唑烷二酮處理組（A1、A2）中等面積（3 000～5 000 μm2）脂肪細(xì)胞出現(xiàn)的頻率總體上比B2組低。在注射后7 天內(nèi)，A1、A2組小面積（1 500～3 000 μm2）脂肪細(xì)胞比B2組下降明顯。注射前1天，A1、A2組中等直徑（60～80 μm）脂肪細(xì)胞比B2組的低；大直徑（＞100 μm）脂肪細(xì)胞趨向于更高。

3 研究結(jié)論

對于有隱性乳房炎的泌乳奶山羊，2，4-噻唑烷二酮處理后對產(chǎn)奶量、乳成分和總體代謝有相對適中的效果，可暫時降低胰島素的敏感性；對炎癥應(yīng)答、體細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的功能有強烈效果；雖然對白細(xì)胞吞噬作用沒有影響，但可增加嗜中性粒細(xì)胞的吞噬能力；可改善機體對乳房感染的回應(yīng)。盡管2，4-噻唑烷二酮不會增加乳脂肪的合成，但可減弱因乳房感染導(dǎo)致乳脂肪合成的下降。2，4-噻唑烷二酮對基因轉(zhuǎn)錄沒有或只有極小的影響。

原文：Fernanda R，Johan S O，Erminio T，et al. 2，4-Thiazolidinedione treatment improves the innate immune response in dairy goats with induced subclinical mastitis[J]，PPAR Research，2017：1-22.