急性心肌梗死患者血漿中microRNA-1、尿路上皮癌相關(guān)1基因的表達(dá)及臨床意義

胡龍剛，安毅

急性心肌梗死是臨床的急危重癥，具有發(fā)病率高、病情兇險(xiǎn)、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn)[1]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷，并采取積極有效的方案進(jìn)行治療，是改善患者預(yù)后減少死亡率的重要措施。報(bào)道顯示[2]，約25%的急性心肌梗死患者發(fā)病早期無明顯胸痛等典型臨床癥狀，缺乏特異性心電圖改變，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)如肌酸激酶、肌鈣蛋白也呈陰性，易造成漏診或誤診，延誤治療的最佳時(shí)機(jī)。因此，尋找早期靈敏度高、特異性好的生物學(xué)標(biāo)志物輔助診斷具有重要意義。micro RNA（miRNA）是長(zhǎng)度為20～25nt的非編碼單鏈小分子RNA，通過調(diào)控基因表達(dá)、蛋白質(zhì)的翻譯以及靶RNA的穩(wěn)定性而參與機(jī)體的病理生理過程，miRNA-1（miR-1）是已知的可在心肌組織、骨骼肌組織中表達(dá)的miRNA[3,4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度超過200nt、無編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，介導(dǎo)了胚胎發(fā)育、惡性腫瘤及心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，尿路上皮癌相關(guān)1基因（UCA1）是一種發(fā)現(xiàn)于膀胱移行細(xì)胞癌的lncRNA，作為癌胚基因參與調(diào)控了乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5,6]。本研究通過檢測(cè)發(fā)病不同階段急性心肌梗死患者血漿中miR-1和UCA1水平，旨在探討其在急性心肌梗死中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象和分組 選擇2015年3月～2016年12月于青島大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院心內(nèi)科收治的急性心肌梗死患者67例納入病例組，男性39例，女性28例，年齡39～76歲，平均（56.3±8.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合急性心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：血清心肌標(biāo)志物升高且至少伴有以下任一項(xiàng)臨床指標(biāo)：缺血癥狀；新發(fā)的缺血性心電圖改變；心電圖提示有病理性Q波；影像學(xué)檢查表明有新發(fā)的局部室壁運(yùn)動(dòng)異常，或者新的心肌活性喪失；冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果證實(shí)冠狀動(dòng)脈內(nèi)有血栓；②患者發(fā)病后2 h內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心功能不全以及既往有心肌梗死病史；②肝、腎功能障礙者；③近期有手術(shù)史及重大創(chuàng)傷者；④瓣膜性疾病、急性腦血管疾??；⑤自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾?。虎藓喜⑵渌赡苡绊懕狙芯拷Y(jié)果的疾病。并于同期隨機(jī)選取50例健康體檢者為對(duì)照組，男性29例，女性21例，年齡42～75歲，平均（54.6±9.2）歲。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象及家屬均在知情同意書上簽字。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及設(shè)備 Takara公司提供的RT-PCR試劑盒、RNAisoTMPlus，Ambion公司提供的miScript Reverse Transcription Kit和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit，上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供的miR-1和UCA1引物序列，ABI公司提供的ABI PRISM 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Eppendorf公司提供的微量高速離心機(jī)。

1.2.2 標(biāo)本采集 對(duì)照組入組后，急性心肌梗死患者入院后不同時(shí)段（入院后2 h、8 h、12 h、24 h、7 d、14 d）收集血液標(biāo)本4 ml。將血液自然凝固，然后以2000 r/min的速度離心10 min，收取血漿并置于1.5 ml的EP管中，保存于-20℃環(huán)境下，留待檢測(cè)。

1.2.3 提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄 嚴(yán)格按照Trizol試劑盒上的要求提取血漿中的總RNA，采用PCR引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)miR-1和UCA1引物序列，并嚴(yán)格按照試劑盒上的要求進(jìn)行相關(guān)操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。miR-1上游引物序列：5’-GGGGTGGAATGTAAAGAA-3’，下游引物序列：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；UCA1上游引物序列：5’-ACGCTAACTGGCACCTTG TT-3’，下游引物序列：5’-TGGGGATTACT GGGGTAGGG-3’；U6上游引物序列：5’-GC TTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。建立20μl的RT混合反應(yīng)體系：2μl濃度為2.5mmol/L的dNTP，0.3μg的total RNA，0.5μl濃度為1μmol/L的RT特異引物，2μl濃度為10U/μl的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，0.3μl濃度為40U/μl的RNA酶抑制劑，2μl的10×RT Buffer，加入無RNA酶的水至總體積為20μl，反應(yīng)條件為10℃ 30 min，40℃ 40 min，85℃ 5 min。構(gòu)建20μl的PCR反應(yīng)體系：1μl的通用引物，1μl的目的引物，10μl的QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，1μl的模板CDAN，7μl的無DNA酶水，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，連續(xù)40個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)條件為95℃ 15s，60℃ 20s，72℃ 20s，77℃ 20s。采用ABI 7000軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，樣本表達(dá)量以qRT-PCR熒光信號(hào)中達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）為標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)樣本均重復(fù)循環(huán)3次，miR-1、UCA1的相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△Ct表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件錄入及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，miR-1、UCA1的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿miR-1、UCA1水平比較 病例組患者血漿miR-1的水平高于對(duì)照組，血漿UCA1的水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），表1。

2.2 不同時(shí)段急性心肌梗死患者血漿miR-1、UCA1水平變化 急性心肌梗死患者入院后，血漿miR-1水平先呈逐漸上升趨勢(shì)，在24 h達(dá)到最高值，隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，并且入院后2 h、14 d的血漿miR-1水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；血漿UCA1水平先呈逐漸下降趨勢(shì)，在24 h降到最低值，隨后呈逐漸上升趨勢(shì)，且入院后2 h、14 d時(shí)仍低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），圖1。

表1 兩組血漿miR-1、UCA1水平比較

圖1 急性心肌梗死患者血漿miR-1、UCA1水平隨入院時(shí)間的變化趨勢(shì)

2.3 急性心肌梗死患者血漿miR-1與UCA1的相關(guān)性 經(jīng)相關(guān)分析，急性心肌梗死患者血漿miR-1與UCA1水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，r=-0.497（P＜0.05）；入院后2 h、8 h、12 h、24 h、7 d、14 d，血漿miR-1與UCA1水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.498、-0.492、-0.531、-0.596、-0.422、-0.495，P均＜0.05）。

3 討論

急性心肌梗死主要指冠狀動(dòng)脈發(fā)生急性阻塞或血流減少而導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，甚至引發(fā)心肌壞死的心肌缺血性疾病，嚴(yán)重威脅患者健康和生命質(zhì)量[8]。心電圖和心肌血清酶譜檢查是臨床輔助診斷急性心肌梗死的常見手段。肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白等是輔助診斷常見的心肌血清酶譜，但研究表明[4,9]，肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶在發(fā)病早期靈敏度較低，可能延誤對(duì)病情診治，肌紅蛋白無法區(qū)分心肌和骨骼肌的損傷，缺乏特異性。

miRNA是在抑制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)、促進(jìn)靶向mRNA的降解過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA，能夠介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等過程，研究顯示，miR-21[10]、miR-133[11]、miR-208[12]等miRNA與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)。Cheng等[13]結(jié)果表明，miRNA在急性心肌梗死發(fā)病早期即可發(fā)生改變，并且具有細(xì)胞特異性，可在血漿、尿液中穩(wěn)定表達(dá)。miR-1是參與心肌缺血、心肌肥厚、心律失常等心血管系統(tǒng)病理過程的miRNA，Pan等[14]構(gòu)建的大鼠心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)，miR-1在大鼠心肌梗死后迅速表達(dá)，且能穩(wěn)定存在超過24 h。有研究表明[9]，miR-1高表達(dá)于急性心肌梗死患者血清中，是反映急性心肌梗死損傷的重要標(biāo)志物。Lnc RNAs與mRNA有相同的特點(diǎn)，即自身不編碼蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)[15]，Lnc RNAs可在心肌梗死患者心肌組織、血液等表達(dá)，而心臟特異性Lnc RNAs參與調(diào)控心肌重塑過程，作為心血管疾病相關(guān)的靶向分子及生物標(biāo)志物有重要價(jià)值。UCA1是主要表達(dá)于卵巢癌[16]、乳腺癌[17]等惡性腫瘤組織的膀胱特異性Lnc RNAs，研究顯示[18]，成人組織中UCA1僅在脾臟、心臟中表達(dá)，并在心臟中呈明顯高表達(dá)，因此有望成為心臟的特異性標(biāo)志物。

本研究通過檢測(cè)急性心肌梗死患者血漿中miR-1、UCA1水平，旨在探討其在急性心肌梗死中的作用。結(jié)果顯示，急性心肌梗死患者血漿中miR-1呈高表達(dá)，且高于健康體檢者，而UCA1呈低表達(dá)，低于健康體檢者，提示miR-1、UCA1可能參與了急性心肌梗死的發(fā)病過程。進(jìn)一步分析，急性心肌梗死患者血漿miR-1與UCA1水平呈負(fù)相關(guān)，不同時(shí)間點(diǎn)，也均呈負(fù)相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[19]，miR-1通過介導(dǎo)氧化而下調(diào)UCA1表達(dá)，急性心肌梗死發(fā)生后，miR-1表達(dá)水平升高可直接或間接與UCA1結(jié)合，進(jìn)而抑制UCA1的表達(dá)而導(dǎo)致其水平下調(diào)，隨后miR-1水平逐漸降低，UCA1可從損傷的心肌釋放至血液中，導(dǎo)致UCA1水平逐漸上升。綜上所述，miR-1、UCA1在急性心肌梗死患者發(fā)病后異常表達(dá)，并隨時(shí)間的變化波動(dòng)改變，可能參與了急性心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展過程，聯(lián)合檢測(cè)可能作為臨床輔助診斷急性心肌梗死的標(biāo)志物。

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