黃芩素對阿霉素腎病大鼠腎小管上皮細胞PERK-CHOP凋亡通路的作用*

★ 周昕 李蕓 楊俊 易鐵鋼 易無庸（深圳市中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院腎病科廣東 深圳 518033）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是一類嚴重威脅人類健康的疾病，蛋白尿是CKD進展的重要危險因素，蛋白尿引起的腎小管損傷在腎臟疾病進展中扮演了重要角色［1］。蛋白尿導致的腎小管上皮細胞（tubular epithelial cell，TEC）凋亡是腎小管萎縮進而走向小管間質纖維化的重要因素［2］。在各種凋亡通路中，內質網(wǎng)應激相關 PERK-CHOP（PKR-like endoplasmic reticulum kinase，C/EBP-homologous protein） 通 路 在 蛋 白尿腎小管損傷中起到了重要作用［3］。阿霉素腎?。╝driamycin nephropathy，AN）動物模型是一種慢性持續(xù)性蛋白尿模型，對研究持續(xù)性蛋白尿誘導的腎小管損傷具有很好的價值［4-6］。有研究顯示黃芩素對腎臟疾病有一定的保護作用［7-9］，但其是否通過調節(jié)PERK-CHOP凋亡通路起到腎小管保護作用尚未見報道，本研究擬從PERK-CHOP凋亡通路探討黃芩素對蛋白尿腎小管損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 18只雄性Wistar大鼠，體重170～220 g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗期間自由飲水、攝食。

1.1.2 實驗用藥、試劑及主要儀器 阿霉素（Sigma Aldrich，St. Louis，MI，USA），黃芩素（南京崇原生物有限公司），p-PERK一抗（Cell signaling Tec，MA，USA），western blot濃度為1∶500，免疫組化濃度1∶100，CHOP一抗（Cell signaling Tec，MA，USA），western blot濃度為1∶1000，免疫組化濃度為 1∶100，二 抗（Cell signaling Tec，MA，USA），免疫組化試劑盒（Maixin-Bio，F(xiàn)uzhou，China），TUNEL 檢測試劑盒（Merck，Darmstadt，Germany），大鼠代謝籠（Tecniplast，Buguggiate，Italy），熒光顯微鏡（Nikon Corporation，Tokyo，Japan），垂直電泳儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），轉膜儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），羅氏全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及干預 將18只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組（正常組，n=6）、阿霉素腎病組（模型組，n=6）和阿霉素腎病+黃芩素觀察組（觀察組，n=6），模型組和觀察組一次性尾靜脈注射阿霉素2.0 mg/kg誘導阿霉素腎病動物模型，正常組注射等量生理鹽水。造模后第1d開始，觀察組予黃芩素300mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予等量蒸餾水灌胃，共治療12周。

1.2.2 標本采集與保存 黃芩素干預12周后，使用大鼠代謝籠收集各組大鼠24h尿液標本。血液和腎臟組織樣本采集：10%水合氯醛按35mg/100g腹腔注射麻醉，沿腹正中線剖開腹腔，從腹腔靜脈采集血液樣本，離心后留取血清，摘除腎臟，切取一半左腎用10%福爾馬林固定，經脫水，透明，石蠟包埋，切片4μm，行腎組織細胞凋亡檢測（TUNEL試劑盒測定）及免疫組織化學染色（p-PERK及CHOP）。剩余腎組織分離皮髓質后凍存于-80℃冰箱，使用Western blot方法檢測腎皮質中p-PERK和CHOP蛋白含量。

1.2.3 標本測定 使用羅氏全自動生化分析儀測定24h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清總蛋白、血肌酐、血尿素氮。使用TUNEL試劑盒檢測腎組織細胞凋亡情況，計數(shù)方法：每個樣本隨機選取5個高倍鏡下視野（HPF，40×物鏡），每個視野計數(shù)TUNEL陽性TEC個數(shù)，計算其平均值。免疫組化方法檢測腎組織中p-PERK和CHOP的表達分布，Western blot方法檢測腎皮質組織中p-PERK及CHOP蛋白的含量，結果以β-actin作為內參進行比較，使用Bio-Rad全能成像儀（Bio-Rad Laboratories，California，USA）進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 各組大鼠24h尿總蛋白定量變化 第12周時，與正常組比較，模型組24h尿總蛋白定量明顯升高，黃芩素干預12周后，觀察組較模型組有明顯降低（圖1）。

圖1 各組大鼠24h尿總蛋白定量變化圖

2.2 各組大鼠血清白蛋白、總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化 第12周時，與正常組比較，模型組血清白蛋白明顯下降（圖2a），血清總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化無明顯統(tǒng)計學意義（圖2b，c，d）；觀察組血清白蛋白較模型組明顯升高（圖2a），血清總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化無統(tǒng)計學意義（圖2b，c，d）。

圖2 各組大鼠血清白蛋白、總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化圖

2.3 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況 第12周時，與正常組比較，模型組TUNEL陽性TEC數(shù)量明顯增加，觀察組較模型組明顯減少（圖3）。

圖3 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況圖

2.4 免疫組化染色顯示 p-PERK和CHOP主要表達于腎小管，腎小球可少量表達（圖4a）。Western blot結果顯示腎皮質組織中，模型組p-PERK、CHOP較正常組明顯增多，黃芩素治療12周后p-PERK、CHOP明顯下降（圖4b，c，d）。

圖4 各組大鼠免疫組化染色比較圖

3 討論

腎小管損傷在CKD進展中起到重要作用，持續(xù)大量蛋白尿可通過誘導TEC凋亡促進小管萎縮、間質纖維化的發(fā)展［10］。細胞凋亡是細胞在一定信號刺激下出現(xiàn)的自主性、程序性細胞死亡，PERK是定位于內質網(wǎng)膜上的一種跨膜蛋白，p-PERK為其活化狀態(tài)，很多因素可導致內質網(wǎng)功能的內穩(wěn)態(tài)失衡，形成內質網(wǎng)應激，早期可促進細胞存活，隨著內質網(wǎng)應激的延長，PERK則通過誘導CHOP表達促進細胞凋亡［11］。

本研究結果顯示AN進展至12周時，模型組24h尿蛋白定量明顯增加，血清白蛋白明顯降低，這表明動物模型已進入持續(xù)性大量蛋白尿期。該狀態(tài)下，TEC細胞凋亡數(shù)量明顯增加，Western blot結果顯示PERK-CHOP通路顯著活化，而免疫組化染色結果顯示p-PERK、CHOP主要表達在TEC細胞中，腎小球中僅有少量表達，這表明PERK-CHOP凋亡通路可能參與了TEC細胞的凋亡進展。黃芩素治療12周后，觀察組24h尿蛋白定量顯著降低，血清白蛋白明顯升高，TEC凋亡數(shù)量減少，腎皮質組織中p-PERK和CHOP的蛋白含量也明顯下降，表明黃芩素可能通過調節(jié)PERKCHOP凋亡通路起到保護AN腎小管損傷的作用，但其制尚需進一步研究。

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