2016～2017年膠東地區(qū)商品肉雞H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列分析

董偉峰

（山東萊州市文昌路畜牧獸醫(yī)站，山東 萊州 261400）

禽流感是正黏病毒科A型流感病毒屬成員，我國自1994年首次在廣東省分離到H9N2亞型AIV以來，該亞型的流感病毒一直在我國雞群中廣泛流行[1]。近年來H7N9、H10N8感染人群的相關研究報道顯示，H9N2在這些病毒的重組演化過程中為其提供了內部基因，對病毒的變異起到了關鍵的作用[2,3]。山東地區(qū)是全國重要的肉雞規(guī)?；B(yǎng)殖大省，近年來冬春季節(jié)H9N2的發(fā)病率居高不下，感染禽臨床表現(xiàn)上呼吸道感染、支氣管栓塞、氣囊炎等癥狀，與其它病原體共感染時，還可引起免疫抑制[4]，導致雞群生長緩慢，死亡率增加，給商品肉雞養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失。

HA蛋白是流感病毒表面最重要的糖蛋白，是流感病毒的主要保護抗原，可以誘導產(chǎn)生中和抗體?；诳乖院虷A基因血凝素分析，H9N2在國內被劃分為三種主要的遺傳分支：①A/Chicken/Beijing/1/94(BJ94)或the A/Duck/Hong Kong/Y280/97(Y280)；② A/Quail/Hong Kong/G1/97(G1)； ③ A/Duck/Hong Kong/Y439/97(Y439)。研究報道，近幾年在中國的雞群中一種由A/chicken/Zhejiang/HJ/2007為代表的新的基因型(G57分支)占到主導地位[5]。BJ94型病毒主要在雞中流行，而在華東和華南地區(qū)已經(jīng)被A/Ck/Shanghai/F/98(F98)所代表的F98型病毒逐漸取代[6]。

當前H9N2滅活疫苗在山東地區(qū)商品肉雞中廣泛應用，但臨床發(fā)病仍然居高不下，為了在分子水平上闡述當前山東地區(qū)商品肉雞H9N2的遺傳變異特征，本研究對2016～2017年從山東省膠東地區(qū)發(fā)病肉雞分離的13株AIV（H9N2亞型）的HA基因進行了序列分析，以期從分子生物學角度了解山東省H9N2亞型禽流感病毒的變異規(guī)律，為商品肉雞H9N2禽流感的預防提供參考。

1 材料和方法

1.1 毒株 13株H9N2亞型禽流感病毒流行株由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所按照參考文獻中的方法進行分離、鑒定及純化[1]。其毒株代表號依次為XT31、XT33、XT34、XT35、XT39、XT43、XT44、XT46、XT205、XT208、XT211、MHS3、MHS5。

1.2 主要試劑 SPF雞和雞胚均由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞研究中心提供。Trizol、DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、pMD18-T Vector、限制性內切酶和一步法RT-PCR試劑盒均購自大連寶生物有限公司。

1.3 引物合成 參考GenBank上已發(fā)表的H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列，利用Oligo6.0軟件設計了兩對引物，由上海生工生物工程有限公司合成，用于擴增HA基因全長序列。

HA1片段預計擴增長度為574bp，引物序列為:

HA1-U:AGCAAAAGCAGGGGAATTTCAC；HA1-L:CTCTATTATTTGTGTATTGGGCGTC。

HA2片段預計擴增長度為1353bp，引物序列為:

HA2-U:ACTAAGGTCACTTTTTAGCTCTGCT；HA2-L:AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGC。

1.4 病毒 RNA的提取及HA基因的RT-PCR擴增 按照Trizol試劑盒說明書提取病毒RNA，取適量DEPC處理的超純水溶解RNA。RT-PCR采用大連寶生物工程有限公司的一步法提取試劑盒，按說明書進行。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 凝膠提取試劑盒回收陽性產(chǎn)物，將回收物連接pMD18-T Vector，16℃，1.5h， 后轉化至感受態(tài) DH5α，37℃震蕩1h后，均勻涂布含Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)14～16h。挑取白色菌落37℃培養(yǎng)過夜，提取質粒做EcoRⅠ酶切和PCR擴增雙重鑒定。將所得的兩段HA序列拼接，并結合GenBank上已發(fā)表的16株H9N2禽流感病毒株的HA基因序列，毒株具體信息及登錄號詳見表1。

表1 H9N2毒株及其具體信息和基因登錄號

取HA基因的全長氨基酸片段對分離株和參考株進行基因分型，利用DNASTAR和Mega5.10軟件，分析H9N2的HA1/HA2裂解位點氨基酸序列，比較分離毒株與國內外近期發(fā)生的不同宿主源H9N2的HA基因的同源性，繪制系統(tǒng)進化發(fā)育樹，從而對上述毒株的HA基因分子遺傳變異情況進行分析。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR結果 RT-PCR產(chǎn)物在0.01g/ml的瓊脂糖凝膠中電泳，發(fā)現(xiàn)HA1在600bp處出現(xiàn)特異條帶，HA2在1300bp處出現(xiàn)特異條帶，電泳結果與預期大小一致。

2.2 重組質粒限制性內切酶鑒定結果 將提取的質粒通過PCR和酶切后獲得兩條電泳帶，分別為600bp和1300bp左右，初步表明HA基因分段擴增獲得了陽性克隆。

2.3 分離株HA基因核苷酸和氨基酸序列分析與比較 將雙向測序結果用Dnaman軟件拼接，獲得13株H9N2亞型AIV的HA基因的cDNA全序列，全長1742bp，ORF全長為1683個核苷酸，位置為34～1716位核苷酸，編碼560個氨基酸。將13個分離株與GenBank上發(fā)表的參考毒株進行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較，結果如圖1、圖2所示。分離株與BJ94參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸序列之間的同源性為90.0%～93.4%；與A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）參考毒株 HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸序列之間的同源性為93.6%～97.0%；而分離株之間的HA基因核苷酸同源性為94.1%～99.8%，氨基酸序列之間的同源性為94.3%～100%。

圖1 H9N2分離株與參考株HA基因核苷酸同源性比較

圖2 H9N2分離株與參考株HA基因氨基酸同源性比較

通過DNAStar軟件對所分離毒株的氨基酸序列進行分析，包括HA裂解位點附近的氨基酸序列、構成受體結合位點的氨基酸序列和潛在的糖基化位點，具體結果見表2、表3。

表2 分離株HA基因裂解位點序列及潛在糖基化位點分析

表3 H9N2分離株與參考株HA基因序列關鍵位點的比較

所有分離株的HA裂解位點均為RSSR↓GLF，有 6～8個潛在的糖基化位點（N-X-T/S，X 為除 P外的氨基酸），XT39毒株在 218～220位和313～315位出現(xiàn)糖基化位點雙缺失，XT205和XT208毒株在218～220位糖基化位點缺失，XT33和MHS3毒株在 551～553位潛在糖基化位點缺失。13株分離株構成HA唾液酸受體結合位點的氨基酸在191位非常保守，為N（天冬酰胺），與經(jīng)典的禽流感國內分離株一致。13株分離株中有3株在198位上變異為A （丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）三種形式。13株分離毒在234位受體結合位點均為L（亮氨酸），具有與哺乳動物唾液酸a，2-6受體結合的特征，該類毒株的流行在公共衛(wèi)生上應值得重視。

2.4 HA基因進化分析 利用 Mega5.10軟件，結合已發(fā)表的16株H9N2禽流感參考毒株的HA基因序列對HA基因的遺傳進化關系進行分析，并繪制了基因進化樹（圖3）。由圖3可知新分離株同屬于歐亞分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994(A/Duck/Hong Kong/Y280/97)亞群，與近年在中國雞群中流行的由A/chicken/Zhejiang/HJ/2007為代表新的基因型(G57分支)遺傳關系最近，推測是由其進化演變而來。

圖3 H9N2AIV分離株和參考毒株HA基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

3 討論

自1966年首次分離獲得H9N2亞型AIV以來，目前該亞型病毒已普遍存在于世界各國禽群中，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。鑒于HA基因在病毒的吸附、穿膜過程以及病毒的致病力方面均起著關鍵作用，因此持續(xù)開展對H9N2亞型禽流感病毒的HA基因變異分析的研究具有重要的現(xiàn)實意義。本研究對 2016～2017年來源于山東省商品肉雞樣品中分離鑒定的13株H9N2亞型AIV的HA基因進行擴增和測序。結果表明，分離株與BJ94參考疫苗毒株HA基因核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸序列之間的同源性為90.0%～93.4%；與 A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸之間的同源性為93.6%～97.0%；而13株分離株之間的HA基因核苷酸同源性為94.1%～99.8%，氨基酸序列之間的同源性為94.3%～100%。結果顯示與當前疫苗毒株具有較大差異。13株分離毒HA基因均與A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）在同一分支，這是否是當前商品肉雞免疫失敗引起臨床發(fā)病的原因還需進一步研究。

HA裂解位點的氨基酸序列是決定AIV毒力的關鍵因素。研究表明，高致病力禽流感在機體內可被多種蛋白酶識別和裂解，具有廣泛的組織嗜性，而低致病力毒株的HA在其裂位點附近通常只有一個精氨酸，只能被消化道和呼吸道內有限的蛋白酶識別，通常只引起這些組織的局部感染[7]。本研究中所分離的13株毒株的裂解位點氨基酸序列均為RSSR↓GLF，符合低致病性禽流感裂解位點的氨基酸序列特征。

HA基因除了決定病毒的致病力外，還決定其宿主范圍。Matrosovich等[8]研究表明人源和禽源禽流感病毒在HA糖基化程度及受體不同成分結合能力均存在差異，禽流感HA上的受體結合位點呈 袋 狀 ， 由 109、151、163、191、198、202、203 和146～150、232～237aa 構成，這些位點的氨基酸相當保守，其中191aa(組氨酸)被認為是13種亞型的AIV病毒HA中都十分保守的一個氨基酸[9]，本研究中分離株191aa均為天冬酰胺，與葉賀佳等[10]報道的一致。而198aa的變異為A、T、M。其他構成受體結合位點袋狀結構的氨基酸在H9亞型內都很保守。劉金華等[11]報道可以感染哺乳動物和人類的H9N2亞型禽流感病毒在HA的234位為L（亮氨酸），具有與哺乳動物唾液酸α，2～6受體結合的特征，不能使人致病的H9N2亞型禽流感病毒HA基因的234位氨基酸是Q（谷氨酰胺），而本研究中所有分離株在234位為L（亮氨酸），因此商品肉雞場中該類型毒株的流行在公共衛(wèi)生上更值得重視。

HA上潛在的糖基化位點對病毒的受體親和力、病毒毒力等多種生物學特性有影響。受體結合位點附近的糖基化會影響AIV和宿主細胞的結合水平，裂解位點附近的糖基化位點還可能影響到蛋白酶對HA前體蛋白的裂解。本研究中所有分離毒株在245～247位糖基化位點缺失，但在313～315位出現(xiàn)了一個新的潛在糖基化位點，糖基化位點的對本毒株毒力的影響尚需進一步驗證。分離株HA基因與16株參考株的HA基因遺傳系統(tǒng)進化關系表明，分離株與A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）分離株遺傳關系最近，與疫苗株關系已遠，懷疑該病毒可能是通過某種方式從長三角地區(qū)傳遞過來的。禽流感H9N2病毒也是多個片段共同作用的結果，除HA外，NA、NS、PB2等基因均可影響該分離株的致病力和抗原性，這些基因的變異能否改變病毒的毒力有待進一步研究。

本研究中通過對分離株分子生物學特征進行分析表明，目前H9N2病毒亞型呈現(xiàn)變異趨勢，盡管裂解位點序列為RSSR↓GLF，顯示仍為低致病力毒株。但生產(chǎn)中不斷出現(xiàn)的商品肉雞發(fā)病，給我們的臨床防控工作帶來了一定的難度，同時給我們的疫苗開發(fā)和疫情監(jiān)測提出了更高的要求。因此，我們應該加強H9N2病毒的分子流行病學監(jiān)測工作，及時了解掌握該病毒的變異趨勢和進化規(guī)律，更好地為生產(chǎn)一線防控工作提供依據(jù)和指導。

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