尼古丁增強(qiáng)肺癌細(xì)胞耐藥性與Bcl-2家族蛋白的關(guān)系*

趙勁風(fēng)，史夏青，王成志，楊滿意，劉玲，廖明媚

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

肺癌是世界最常見(jiàn)的癌癥之一，因其確診較晚，導(dǎo)致預(yù)后不良，發(fā)病率和病死率持續(xù)上升，已是我國(guó)癌癥病死率的第1位[1]。吸煙會(huì)大幅增加吸煙者患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，且導(dǎo)致約90%的肺癌患者死亡[2]。香煙煙霧是包含超過(guò)4 000多種化學(xué)物質(zhì)的復(fù)雜混合物，大部分是有害物質(zhì)或致癌物，包括尼古丁、芳香烴、醛及氰化物等[3]。尼古丁是香煙煙霧中以酸鹽形式存在的主要化學(xué)成分，在肺部吸收，被認(rèn)為是吸煙成癮的主要因素[4-5]。

近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，肺癌治療的效果可被尼古丁所影響，其作用機(jī)制為尼古丁通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種不同信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成，并抑制肺癌細(xì)胞的凋亡。例如：尼古丁可以從肺癌細(xì)胞的乙酰膽堿受體上取代乙酰膽堿，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，并激活PI3K，AKT，MAPK，PKC等蛋白激酶，促進(jìn)增殖，使癌細(xì)胞凋亡減少[8]。本文主要闡述尼古丁影響B(tài)細(xì)胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/leukelia-2,Bcl-2）家族蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)展并降低化療藥物的敏感性。

1 尼古丁的化學(xué)性質(zhì)及作用

尼古丁是煙草的主要成分，它含有1個(gè)吡啶基和1個(gè)吡咯環(huán)，2個(gè)結(jié)構(gòu)上都帶有1個(gè)叔胺，可以在煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）的多個(gè)位置選擇性結(jié)合。人體大腦、肺、神經(jīng)肌肉接頭、腎上腺髓質(zhì)和神經(jīng)節(jié)等都有nAChRs[9]。當(dāng)尼古丁經(jīng)吸煙吸入時(shí)，通過(guò)肺部擴(kuò)散進(jìn)入循環(huán)，最終進(jìn)入大腦刺激多巴胺釋放，使吸煙者感覺(jué)十分愉悅，所以尼古丁是吸煙成癮的主要原因[4]。

在煙草加工和吸煙時(shí)尼古丁可以通過(guò)亞硝化作用轉(zhuǎn)化為4-甲基亞硝胺-1（3-吡啶基）-1-丁酮、4-甲基亞硝胺-1（3-吡啶基）-1-丁醇（NNK）和N-亞硝基去甲基尼古?。∟NN），入機(jī)體后迅速的被吸收并分布到整個(gè)機(jī)體[10]。尼古丁及其衍生物（NNK，NNN）可誘導(dǎo)各種癌細(xì)胞（包括肺、胰腺、膀胱、頭、頸和神經(jīng)膠質(zhì)）的存活、增殖、遷移及侵襲等[11]。尼古丁通過(guò)激活癌細(xì)胞上的nAChRs，進(jìn)而激活或直接增強(qiáng)下游抗凋亡信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生存，抑制癌細(xì)胞凋亡[12]。

2 肺癌耐藥性的產(chǎn)生及機(jī)制

化療成為治療中晚期肺癌的重要手段[13]，可以提高肺癌患者的生存率，減輕癥狀，提高生活質(zhì)量。但是在化療過(guò)程中，肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物容易產(chǎn)生耐受性，導(dǎo)致化療失敗，這加劇了肺癌患者的不良預(yù)后從而導(dǎo)致高病死率[14]。近年來(lái)研究表明[14-16]，肺癌耐藥的產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中相關(guān)因子（PKC、PI3-K/AKT、NF-κB等）及凋亡相關(guān)基因（P53、Survivin、Bcl-2基因家族等）的表達(dá)異常存在密切聯(lián)系。

3 尼古丁增強(qiáng)肺癌耐藥性與Bcl-2家族蛋白的關(guān)系

3.1 Bcl-2家族與細(xì)胞凋亡

Bcl-2這一基因家族主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)，可以調(diào)控線粒體膜通透性，釋放凋亡因子細(xì)胞色素C和激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)等，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的調(diào)控因子[17]。Bcl-2蛋白家族可以分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，促凋亡蛋白由BH123和BH3-only 2個(gè)亞族組成，BH123亞族主要包含Bak和Bax，而BH3-only亞族包括Bid、Bim、Bad、Bik、Puma和Noxa；抗凋亡蛋白由Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-b和A1等組成[18]。細(xì)胞沒(méi)有凋亡刺激時(shí)，抗凋亡蛋白在線粒體外膜上結(jié)合BH123蛋白和Bak、Bax，從而抑制其活化，所有抗凋亡蛋白都可以隔離Bax，而只有Mcl-1和Bcl-xl可以結(jié)合Bak。細(xì)胞在接受凋亡刺激之后，BH3-only蛋白部分與抗凋亡蛋白結(jié)合，使抗凋亡蛋白不能再與BH123蛋白相互作用，或直接與BH123蛋白結(jié)合以激活它們?；罨腂ax和Bak同二聚化，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C和其他膜間蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，使半胱天冬酶激活，然后是DNA片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6，17，19]。因此，Bcl-2家族蛋白的表達(dá)及其之間的相互作用可以影響細(xì)胞凋亡。

3.2 BH123亞族與尼古丁增強(qiáng)肺癌耐藥性的關(guān)系

3.2.1 BH123亞族的結(jié)構(gòu)與功能 Bax和Bak是Bcl-2基因家族中具有BH1-3同源結(jié)構(gòu)區(qū)域，對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用的BH123亞族成員，是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑（包括DNA損傷）必不可少的凋亡誘導(dǎo)因子[20]。在正常生理狀態(tài)下，Bax主要以單體形式位于細(xì)胞質(zhì)中或吸附在線粒體外膜上，可形成Bax/Bcl-xl、Bax/Bcl-2異二聚體；Bak不同于Bax，大多數(shù)Bak以Bak/Mcl-1、Bak/Bcl-xl異二聚體的形式吸附在線粒體外膜上。細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，Bax和Bak均吸附到線粒體膜上，形成寡聚體，促進(jìn)凋亡[21]。

3.2.2 BH123亞族與尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生存與耐藥的研究 大多數(shù)肺癌細(xì)胞系都可檢測(cè)出高水平的內(nèi)源性Bax和Bak，且在肺癌細(xì)胞死亡時(shí)表達(dá)很高。其中，Bax已被確定可以作為肺癌治療的預(yù)后指標(biāo)，為肺癌治療提供了一個(gè)新靶點(diǎn)[22]。尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生存與耐藥主要與Bax有關(guān)，與Bak關(guān)系的相關(guān)研究甚少。在凋亡過(guò)程中，Bax的促凋亡活性可以通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化，翻譯后修飾水平來(lái)調(diào)控。Bax的磷酸化S184位點(diǎn)位于其疏水羧基末端，調(diào)控Bax在細(xì)胞內(nèi)的定位及其插入線粒體膜的能力[23]。尼古丁可以激活Bax的激酶AKT，AKT與Bax在細(xì)胞內(nèi)共同作用，并且使Bax磷酸化。Bax的磷酸化使其不能結(jié)合到線粒體膜上，從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，且Bax蛋白的半衰期減短。尼古丁還可以激活Bax的激酶PKC，PKC可直接在肺癌細(xì)胞中磷酸化Bax。因此，尼古丁誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的生存與耐藥性是通過(guò)激活PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的，使Bax磷酸化失去促凋亡功能[23-24]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了特異性靶向的Bax激動(dòng)劑SMBA1-3，可以在Bax的S184位點(diǎn)處結(jié)合引起B(yǎng)ax構(gòu)象變化，促進(jìn)Bax寡聚化，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡[25]。對(duì)于Bax磷酸化，發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶2（PP2A）可作為一種Bax調(diào)節(jié)性磷酸酶發(fā)揮作用，不僅使Bax去磷酸化，而且激活Bax促凋亡功能[26]。因此，SMBAs和PP2A可以作為一種潛在的靶向Bax的新型抗癌藥物，專門用于治療肺癌。

3.3 BH3-only亞族與尼古丁增強(qiáng)肺癌耐藥性的關(guān)系

3.3.1 BH3-only亞族的結(jié)構(gòu)與功能 BH3-only亞族蛋白只有1個(gè)保守的BH3結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括Bid，Bim，Bad，Bik，Puma和Noxa等，通過(guò)線粒體凋亡途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序的，在凋亡的啟動(dòng)及凋亡通路的溝通中發(fā)揮著極其重要的作用[27]。BH3-only蛋白主要通過(guò)結(jié)合抗凋亡蛋白并抑制其活性，使Bax和Bak釋放，引起線粒體外膜透化，激活半胱天冬酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[28]。

3.3.2 BH3-only亞族與尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生存與耐藥的研究 BH3-only亞族蛋白成員Bad、Bim、Puma和Noxa在肺癌細(xì)胞中均可檢測(cè)到有表達(dá)。Bad在大多數(shù)肺癌細(xì)胞系中都有高表達(dá)，且與其生存和耐藥有很大關(guān)系。Bim的表達(dá)水平的降低或Bim缺失多態(tài)性的存在會(huì)降低肺癌治療效果，且影響術(shù)后患者的預(yù)后。而Puma和Noxa在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)與其發(fā)病機(jī)制可能并沒(méi)有很重要的關(guān)系[29]。

尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生存與耐藥主要與Bad相關(guān)。Bad是BH3-only亞族中的一個(gè)重要蛋白，可以在S112，S136和S155 3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，其促凋亡活性主要與磷酸化水平相關(guān)[30]。據(jù)報(bào)道，尼古丁可以激活肺癌細(xì)胞內(nèi)的MAPK ERK1/2，AKT和PKA等激酶，引起B(yǎng)ad先后在S112，S136和S155 3個(gè)位點(diǎn)磷酸化，磷酸化的Bad不再與Bcl-2或者Bcl-xl結(jié)合，從線粒體膜上轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，并與細(xì)胞質(zhì)中的14-3-3蛋白相互作用，失去其促凋亡活性[31]。

近年來(lái)，也有文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)MAPK ERK1/2，AKT和PKA等激酶活化的抑制劑。PD98059和U0126是常見(jiàn)的MAPK ERK1/2激酶抑制劑[32]。AKT位于PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心位置，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖和代謝等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要功能，已有十幾個(gè)AKT小分子抑制劑進(jìn)入臨床開發(fā)階段，如：LY294002，哌立福新，MK2206，GSK2110183等[33-34]。H89是已經(jīng)證明可以在肺癌細(xì)胞中抑制PKA激酶活化。這些對(duì)于激活Bad磷酸化的蛋白激酶有顯著抑制效果的分子抑制劑，均可作為潛在的肺癌治療藥物[35]。

3.4 抗凋亡蛋白與尼古丁增強(qiáng)肺癌耐藥性的關(guān)系

3.4.1 抗凋亡蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 抗凋亡蛋白Bcl-2基因家族中具有BH1-4同源結(jié)構(gòu)區(qū)域，由Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-b和A1等組成?？沟蛲龅鞍卓梢灾苯优cBax或Bak結(jié)合使其失活，并且可以競(jìng)爭(zhēng)性的與BH3-only蛋白結(jié)合抑制其發(fā)揮凋亡活性，從而減少細(xì)胞凋亡[36]。一些惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)提高Bcl-2家族的抗凋亡蛋白表達(dá)來(lái)逃避凋亡，進(jìn)而過(guò)度增殖。因此，抗凋亡蛋白成為抗癌治療的可能靶點(diǎn)。

3.4.2 抗凋亡蛋白與尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生存與耐藥的研究 抗凋亡蛋白在肺癌細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中起到了重要的作用，抗凋亡蛋白通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞的凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間等機(jī)制，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，抗凋亡蛋白在肺癌細(xì)胞中均過(guò)表達(dá)，其中Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表達(dá)最為顯著。目前關(guān)于尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的生存與耐藥的研究大部分與Mcl-1和Bcl-2這2個(gè)蛋白相關(guān)[12]。

Mcl-1是Bcl-2家族成員中一種獨(dú)特的抗凋亡蛋白，具有較短的半衰期和短期抗凋亡功能。在凋亡過(guò)程中，Mcl-1通過(guò)抑制Bax、Bak、BH3-only蛋白起負(fù)調(diào)控內(nèi)源性凋亡的作用[37]。Mcl-1表達(dá)在多個(gè)水平上受到嚴(yán)格調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后和轉(zhuǎn)錄翻譯后過(guò)程，在許多腫瘤中過(guò)表達(dá)，Mcl-1的高表達(dá)與腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[38]。Mcl-1在各種人類肺癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與肺癌細(xì)胞的增殖與耐藥有重要關(guān)系。尼古丁上調(diào)Mcl-1在各種人類肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，還通過(guò)上游β-腎上腺素受體激活ERK1/2通路，其誘導(dǎo)Mcl-1可以在PEST區(qū)域的T163位點(diǎn)磷酸化。在尼古丁誘導(dǎo)Mcl-1的T163位點(diǎn)處磷酸化顯著延長(zhǎng)Mcl-1的半衰期，從1.5～2.2 h延長(zhǎng)至5～6 h，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞長(zhǎng)期存活和對(duì)化療藥物的耐藥性[11，39]。因此，Mcl-1的抗細(xì)胞凋亡功能的破壞可以通過(guò)阻斷其T163位點(diǎn)磷酸化，代表治療煙草相關(guān)癌癥的新策略，尤其適用于肺癌和其他Mcl-1高表達(dá)的惡性腫瘤。

Bcl-2是肺癌細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，研究表明長(zhǎng)期吸煙的肺癌患者的癌細(xì)胞中可以檢測(cè)到高表達(dá)的Bcl-2，因此Bcl-2與肺癌之間有密切的關(guān)系。尼古丁可以上調(diào)肺癌細(xì)胞的Bcl-2的表達(dá)，使肺癌細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性降低，且對(duì)于化療藥物的耐藥性增加[22]；尼古丁對(duì)于Bcl-2的調(diào)節(jié)還表現(xiàn)在磷酸化水平，Bcl-2可以在T69，S70和S87多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，S70位點(diǎn)是尼古丁誘導(dǎo)Bcl-2發(fā)生磷酸化的主要位點(diǎn)，且尼古丁通過(guò)激活PKCα和MAPK ERK1/2激酶激活Bcl-2在S70位點(diǎn)的磷酸化[17]；此外，尼古丁誘導(dǎo)Bcl-2磷酸化還可以增強(qiáng)Bcl2/Bax異源二聚化，阻斷Bax的促凋亡作用。在化療藥物治療肺癌的過(guò)程中，Bcl-2與Keap1結(jié)合，促進(jìn)Bcl-2泛素化并且降解，尼古丁可以抑制Bcl-2與Keap1的相互作用，減弱Bcl-2泛素化，增強(qiáng)Bcl-2穩(wěn)定性[40]。

Bcl-2蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)大大高于在正常細(xì)胞中的表達(dá)，也就是說(shuō)以其為靶點(diǎn)的抑制劑幾乎不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影響，通過(guò)抑制Bcl-2抗凋亡蛋白來(lái)克服肺癌細(xì)胞對(duì)凋亡的耐受是一種基于腫瘤發(fā)病機(jī)制的治療方案，比傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性療法選擇性好、安全性高[41-42]。目前關(guān)于Bcl-2蛋白的抑制劑也有很多，比如：ABT-737，ABT-263，VENETOCLAX等[43]。除Bcl-2外，針對(duì)其他抗凋亡蛋白的小分子抑制劑也在研究中。這類針對(duì)抗凋亡蛋白的小分子抑制劑不僅在肺癌的治療中前景巨大，在其他腫瘤的治療中也是一個(gè)重要選擇。

肺癌的病因至今仍未能完全的闡明，造成其發(fā)生的危險(xiǎn)因素有很多，其中，吸煙是確認(rèn)的與肺癌發(fā)生有關(guān)系的最重要因素[44]。尼古丁對(duì)肺癌治療效果有嚴(yán)重的影響，尼古丁及其代謝產(chǎn)物可以通過(guò)活化乙酰膽堿受體進(jìn)而激活下游Src、Ras-Raf-MAPK-MEK和PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)一步推動(dòng)Bcl-2基因家族蛋白的表達(dá)。本文主要闡述了尼古丁誘導(dǎo)Bcl-2和Mcl-1磷酸化，磷酸化增強(qiáng)其抗凋亡功能；而對(duì)于促凋亡蛋白Bax和Bad的磷酸化，磷酸化使其促凋亡功能失活，這些都有助于增加人類肺癌細(xì)胞的生存和化療耐藥性?；谀峁哦?duì)Bcl-2基因家族蛋白的影響的研究，專門針對(duì)該蛋白磷酸化的分子抑制劑可以作為肺癌治療的研究對(duì)象，為肺癌治療提供一種新的途徑，從而盡可能做到早干預(yù)，抗耐藥，以提高肺癌的治療效果。同時(shí)，對(duì)于肺癌的所有研究均顯示尼古丁誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性仍然只是部分的，表明仍有其他因素導(dǎo)致肺癌細(xì)胞不斷增殖且對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，發(fā)現(xiàn)并尋找這些因素，并且研究該因素對(duì)于細(xì)胞內(nèi)部凋亡通路的影響，將對(duì)肺癌的臨床治療應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。