豬鏈球菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用分析

（北京納百生物科技有限公司，北京 100176）

豬鏈球菌為對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅一種典型人獸共患病原菌，可引發(fā)支氣管肺炎、豬腦膜炎、敗血癥等多種疾病，如何防控是相關(guān)部門(mén)研究的重點(diǎn)。在對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，生化鑒定、細(xì)菌培養(yǎng)均為常用手段，但除檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng)外，且極易出現(xiàn)漏診或誤診事件，準(zhǔn)確度居較低水平[1]。而熒光定量（PCR）特異性、靈敏性均較理想，可有效規(guī)避上述檢測(cè)方式的不足，為疾病控制提供有力參考依據(jù)。本次研究以此展開(kāi)探討，現(xiàn)結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）儀器與試劑：DU640型核酸蛋白儀、PCR儀均購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Premix Ex TaqTM試劑盒由Takara公司提供。（2）菌株：豬生活區(qū)域分布的常見(jiàn)菌群，包括丹毒桿菌、豬副溶血嗜血桿菌、豬布魯氏菌等；豬鏈球菌。

1.2 探針序列

參考豬鏈球菌在GenBank中已呈登錄狀態(tài)的抗原基因序列，對(duì)基因保守區(qū)展開(kāi)細(xì)致的分析；在Primer Express 3.0軟件中，對(duì)極具特異性的探針及引物設(shè)計(jì)，并經(jīng)BLAST，初步鑒定其特異性，合成一對(duì)特異性引物和探針。

1.3 制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品

含部分含有豬鏈球菌抗原基因的片端于PUC57質(zhì)粒上構(gòu)建，對(duì)重組克隆菌予以制備，以在后續(xù)的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)使用。對(duì)重組質(zhì)料有效提取后，在紫外分光光度計(jì)輔助下，獲取OD260和OD280值及兩個(gè)數(shù)值比值，檢測(cè)3次，獲取平均值，對(duì)質(zhì)粒DNA所反映的純度、濃度確定，準(zhǔn)確計(jì)算拷貝數(shù)，按1×105拷貝/ μl稀釋，于-20℃條件下凍存?zhèn)溆?。質(zhì)粒具體的檢測(cè)濃度×6.02×1023與質(zhì)?？傞L(zhǎng)度×600的比值為拷貝數(shù)。

1.4 樣品檢測(cè)及提取DNA

對(duì)15只疑似豬鏈球菌感染的豬扁桃體組織采集，于無(wú)菌條件下，精密稱取1g，在研缽中放置，取生理鹽水2.5ml加入，行研磨及充分混勻處理，取研磨液150μl，應(yīng)用DNA提取試劑盒，有效完成對(duì)基因組DNA的提取工作，模板DNA的純度、濃度應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，DNA樣品獲取后，于-20℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 建立熒光定量PCR體系

在PCR儀上完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)，程序：設(shè)置溫度為42℃，用時(shí)為20min；設(shè)置溫度為95℃，用時(shí)為10min，設(shè)置溫度為94°C，用時(shí)為15s，設(shè)置溫度為55℃，用時(shí)30s，共有循環(huán)40個(gè)。依據(jù)此程序，以陽(yáng)性質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，分別優(yōu)化退火溫度，即52℃～60℃；探針濃度，即2.5～7.5μmol/L；引物濃度，即5～10μmol/L。以2μmol/L對(duì)探針濃度做遞增處理，以2°C對(duì)退火溫度作遞增處理，對(duì)PCR反應(yīng)條件予以優(yōu)化。

1.6 檢測(cè)靈敏性

將豬鏈球菌重組質(zhì)粒向1×105拷貝/μl稀釋，再于10倍系列條件下，對(duì)5個(gè)梯度稀釋，模板為1×101-1×104拷貝/μl，單個(gè)梯度安排3次操作，對(duì)其靈敏度進(jìn)行測(cè)定。1.7 檢測(cè)特異性

應(yīng)用優(yōu)化后方法，對(duì)丹毒桿菌、豬鏈球菌、豬布魯氏菌、豬副溶血嗜血桿菌加以檢測(cè)，設(shè)置空白對(duì)照及陰陽(yáng)性對(duì)照，以對(duì)特異性開(kāi)展驗(yàn)證。

1.8 臨床實(shí)驗(yàn)

取15只疑似豬鏈球菌感染的病豬扁桃體組織總DNA，空白對(duì)照為ddH2O，陽(yáng)性對(duì)照為豬鏈球菌重組質(zhì)粒，陰性對(duì)照為健康豬相同組織總DNA，依據(jù)優(yōu)化條件，完成FQ-PCR擴(kuò)增操作，采用國(guó)標(biāo)法復(fù)驗(yàn)，以對(duì)符合率驗(yàn)證。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

涉及數(shù)據(jù)均輸入spss13.0，組間計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，行x2檢驗(yàn)，P<0.05具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

PCR檢測(cè)擴(kuò)增曲線呈S型、Ct值<35為陽(yáng)性，應(yīng)用所建立的FQPCR法對(duì)靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，最低限度為1×102拷貝/μl的重組質(zhì)粒；特異性檢測(cè)表明，僅豬鏈球菌樣本有的擴(kuò)增曲線，其他非目的模板均無(wú)擴(kuò)增曲線；應(yīng)用此種方法，檢測(cè)15份疑似豬鏈球菌感染組織樣本，陽(yáng)性共14份，相較國(guó)標(biāo)法檢測(cè)，有更高符合率。見(jiàn)表1。

3 討論

本次研究通過(guò)FQ-PCR方法的建立，進(jìn)行豬鏈球菌熒光定量檢測(cè)，取得了理想成效。同普通PCR相比，熒光定量PCR技術(shù)具有便捷、快速、敏感特異性高等特點(diǎn)，已在畜禽疫病診斷中得到廣泛應(yīng)用。此次采取探針與引物結(jié)合的方法，表現(xiàn)出了較高特異性，采用此方法檢測(cè)其他細(xì)菌，僅豬鏈球菌有擴(kuò)增曲線表現(xiàn)出，對(duì)其靈敏性進(jìn)一步證實(shí)，能檢測(cè)到1×102拷貝/μl的重組質(zhì)粒，提示敏感性較理想[2]。應(yīng)用此方法對(duì)15份疑似豬鏈球菌感染的組織檢測(cè)，結(jié)果與細(xì)菌鑒定一致，且陽(yáng)性率優(yōu)于細(xì)菌鑒定，有較為理想的應(yīng)用成效。

綜上，針對(duì)豬鏈球菌，采用熒光PCR檢測(cè)，有較高靈敏度及特異性，符合率居更高水平。

[1]李建達(dá)，于江，張玉玉，等.豬鏈球菌2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2016，43（12）：3107-3133.

[2]王蓉蓉，孫衛(wèi)東，蔣蔚，等.豬鏈球菌2型主要毒力因子三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2014，22（6）：25-31.