獸用疫苗生產(chǎn)過(guò)程中正確檢測(cè)和預(yù)防支原體污染的方法

余彬輝 余艷輝 賈布拖

（1.浙江易健生物制品有限公司，浙江紹興 311800；2.杭州佑本生物制品有限公司，浙江杭州 310018）

隨著我國(guó)獸醫(yī)專(zhuān)業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)于動(dòng)物疾病的診斷技術(shù)水平也不斷地提高，相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)于支原體的認(rèn)識(shí)也更加的深入，現(xiàn)在所知的自然界中存在的這類(lèi)微生物已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了100種，根據(jù)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的報(bào)道可知這100余種的微生物都會(huì)通過(guò)直接或間接的方式對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物造成疾病的感染。如果人或者動(dòng)物感染支原體，會(huì)造成呼吸道出現(xiàn)感染、生長(zhǎng)發(fā)育停滯并且會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成相應(yīng)的損傷。此外，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品也面臨著比較難解決的情況，所以相關(guān)的獸醫(yī)工作者對(duì)此給予了比較廣泛的關(guān)注。

1 相關(guān)概述

支原體屬于原核微生物，不具有細(xì)胞壁，個(gè)體微小，呈高度多態(tài)性，一般是通過(guò)常用的濾菌器，其毒株主要通過(guò)特殊的結(jié)構(gòu)黏附于宿主細(xì)胞膜上，并與相應(yīng)的受體結(jié)合，引起宿主細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變及誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生某些細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)表現(xiàn)出異常，最終可以引起各種疾病的發(fā)生。根據(jù)相關(guān)的試驗(yàn)結(jié)果可知：國(guó)內(nèi)采用的普通疫苗和細(xì)胞生產(chǎn)活毒疫苗被支原體造成了比較嚴(yán)重的污染，這樣對(duì)生物制藥企業(yè)造成非常大的經(jīng)濟(jì)壓力，同時(shí)也不利于畜禽疾病防恐工作的順利開(kāi)展。相關(guān)規(guī)定中注明所有細(xì)胞生產(chǎn)的活疫苗并不能檢測(cè)到支原體的污染情況，所以就要求相關(guān)的技術(shù)人員掌握一定的對(duì)于支原體的檢測(cè)技術(shù)，以保證生物制品生產(chǎn)工作得以比較順利的開(kāi)展和發(fā)展。

2 支原體的檢測(cè)

2.1 傳統(tǒng)檢測(cè)法

直接培養(yǎng)法：我國(guó)的相關(guān)準(zhǔn)則中明確規(guī)定，直接培養(yǎng)法是支原體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。具體主要是將待檢樣品接種到支原體培養(yǎng)基上，對(duì)液體培養(yǎng)基的顏色和固體培養(yǎng)基上支原體菌落的變化進(jìn)行觀察，然后通過(guò)正確的判斷給出試驗(yàn)結(jié)果，這種方法的準(zhǔn)確率比較高但是培養(yǎng)的時(shí)間卻比較長(zhǎng)，同一個(gè)培養(yǎng)基中所有的支原體類(lèi)型并不能全部的檢測(cè)出來(lái)，所以這種檢測(cè)方法一般應(yīng)用于種毒和成品的檢測(cè)方面。

DNA熒光染色法：此種方法也被稱(chēng)為指示細(xì)胞法，此種檢測(cè)方法的耗時(shí)比較短，并且能夠同時(shí)對(duì)于多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并且對(duì)于采用培養(yǎng)法不能檢測(cè)出的支原體給予正確的檢測(cè)，如果有條件在配制疫苗之前就進(jìn)行初步的檢測(cè)，將其中不合格的樣品去除掉，這樣能夠避免相應(yīng)的損失并且對(duì)疫苗的質(zhì)量加以有效的保證。

2.2 血清學(xué)法

被動(dòng)顆粒凝集試驗(yàn)（PPA）：可應(yīng)用于細(xì)菌、支原體的鑒定和抗體的定性檢測(cè)。我國(guó)相關(guān)的專(zhuān)家用此方式對(duì)肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可知被動(dòng)凝集法的操作比較簡(jiǎn)單，但是卻具有比較高的精確性和敏感度，在實(shí)際的臨床生產(chǎn)中可以更有效的應(yīng)用。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：醫(yī)學(xué)界至今為止，用此種方法是診斷人和動(dòng)物肺炎支原體實(shí)用和可靠的方法之一。本檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單并且特異性和敏感性都比較佳，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且成為檢測(cè)肺炎支原體的在臨床中的常規(guī)方法。

2.3 分子生物學(xué)技術(shù)

PCR檢測(cè)技術(shù)：支原體通常生長(zhǎng)都比較緩慢并且對(duì)于營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的要求相對(duì)比較高，并且在種間存在交叉抗原等生物學(xué)特性。隨著相關(guān)領(lǐng)域研究人員逐漸深入對(duì)支原體的核酸結(jié)構(gòu)、分子組成及其特異性的了解，國(guó)際上就已經(jīng)在支原體的檢測(cè)中融入了PCR技術(shù)，在特異性和靈敏性方面有更佳的表現(xiàn)，并且在獸用生物制品的生產(chǎn)中進(jìn)行了廣泛的推廣和應(yīng)用，但是此種方法對(duì)于試驗(yàn)環(huán)境和儀器的要求標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)比較高，所以很容易出現(xiàn)交叉污染的情況，生產(chǎn)中必須給予足夠的重視。

巢式PCR檢測(cè)法：基于PCR檢測(cè)方法加以?xún)?yōu)化改進(jìn)，主要是通過(guò)設(shè)計(jì)巢式PCR引物的方式，根據(jù)擴(kuò)增后是否存在目的片段的情況對(duì)具體的污染狀況加以比較合理且正確的判斷，然后根據(jù)存在片段的大小情況，對(duì)于污染的支原體類(lèi)型進(jìn)行正確的判斷分析，從而將污染源進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：根據(jù)相關(guān)的報(bào)道可知，最初是早在1996年的美國(guó)某家公司第一次推出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)在，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與繁殖、動(dòng)物遺傳育種及動(dòng)物疾病檢測(cè)和預(yù)防等領(lǐng)域已經(jīng)都有了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，但在實(shí)際應(yīng)用中，在應(yīng)用方面沒(méi)有達(dá)到特別廣泛的范圍，從而受到了一定的限制，所以在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)該給予一定的重視。

DNA分子雜交檢查法：原核生物的rRNA是高度保守的。采用這種檢測(cè)方法具有特異性高的特點(diǎn)，可大致的鑒別出污染支原體的種類(lèi)。

3 相關(guān)防治措施

就目前所知的情況，自然界中有多于120種的支原體存在，實(shí)際在生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中，感染支原體的組織細(xì)胞中會(huì)在不同程度上改變細(xì)胞形態(tài)和遺傳物質(zhì)，從而對(duì)病毒的復(fù)制過(guò)程產(chǎn)生一定的影響，同時(shí)會(huì)在不同程度上改變宿主細(xì)胞的免疫能力，從而誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。所以在獸用疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，尤其是將培養(yǎng)細(xì)胞作為材料的疫苗生產(chǎn)情況，應(yīng)該對(duì)于支原體的防治加以重視，決不能忽視。對(duì)于支原體的污染進(jìn)行糾正的時(shí)候應(yīng)該保持細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液呈酸性，這樣對(duì)于抑制支原體的生長(zhǎng)是比較有效的條件。目前我國(guó)從事獸用疫苗生產(chǎn)研究的技術(shù)人員在參與生產(chǎn)生物制品的研制生產(chǎn)過(guò)程當(dāng)中，以檢測(cè)支原體的存在，以及鑒定支原體的種類(lèi)是該手段實(shí)施的主要目的，也就是生產(chǎn)中所說(shuō)的檢測(cè)細(xì)胞的污染源，從而力爭(zhēng)將其切斷，最后才可以對(duì)污染細(xì)胞的相關(guān)來(lái)源采取比較有效的防治手段進(jìn)行干涉，減少甚至是控制細(xì)胞的污染情況。