代謝組學(xué)在中獸藥領(lǐng)域的發(fā)展解析

董玲玲，范 強，于曉輝，楊秀玉，汪 霞

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

代謝組學(xué)是研究生物體系受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物變化的科學(xué)，主要研究小分子代謝物(分子量1000以下)，與蛋白組學(xué), 轉(zhuǎn)錄組學(xué)相互補充, 和基因組學(xué)一起構(gòu)成系統(tǒng)生物學(xué)，成為研究生命現(xiàn)象的重要手段[1]。與其它組學(xué)比較，代謝組學(xué)是對生物體產(chǎn)生變化的最終反映，檢測相對容易：因為基因和蛋白表達的有效的微小變化會在代謝物上得到放大；代謝物種類遠小于基因和蛋白的數(shù)目；代謝組學(xué)技術(shù)不需建立全基因組測序及大量表達序列標(biāo)簽(EST)的數(shù)據(jù)庫[2]；同時，各生物體系中的代謝產(chǎn)物是類似的，因此代謝組學(xué)研究所采用的技術(shù)手段通用性更強。目前，代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物研究[3]、疾病診斷[4]、植物鑒定[5]、營養(yǎng)學(xué)[6]、微生物代謝[7]、食品安全[8]等領(lǐng)域的研究。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，其在中藥研究的各領(lǐng)域也逐漸興起并占有一席之地。文章介紹了代謝組學(xué)的研究方法，根據(jù)其在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀預(yù)測其在中獸藥作用機制研究、毒理及安全評價研究、質(zhì)量控制方面具有良好的應(yīng)用前景，同時對其在未來發(fā)展中面臨的挑戰(zhàn)進行了探討。

1 代謝組學(xué)研究方法

代謝組學(xué)研究流程包括樣品采集和前處理、樣品分析以及數(shù)據(jù)處理等，樣品采集和前處理與樣品分析緊密相關(guān)：只有經(jīng)過適當(dāng)?shù)那疤幚? 才能保證對樣品所做的分析結(jié)果具有可信度，同時不同的儀器分析技術(shù)對于樣品的前處理有不同的要求。代謝組學(xué)產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)處理是代謝組學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)，正確的數(shù)據(jù)處理和分析是獲得具有統(tǒng)計意義和生物學(xué)意義結(jié)果的前提。

1.1 樣品采集和前處理 代謝組學(xué)研究的對象為廣泛存在于細胞、血液、尿液、組織中的小分子代謝物。為了保證樣品分析的順利進行和分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，樣品采集與前處理的關(guān)鍵就在于1)提取出盡可能多的代謝物；2)經(jīng)過前處理，降低樣品對分析儀器的不利影響，同時提高檢出率。例如尿液樣品中主要為小分子極性代謝物,包括羧酸類、有機胺類、氨基酸類。在使用NMR測定時,不同pH值尿液中這些代謝物由于氨基或羧基的解離程度不同,化學(xué)位移將發(fā)生顯著的變化，因此，選擇合適的pH值顯得尤為重要[9]。在樣品分析前利用適當(dāng)?shù)姆椒▽悠愤M行前處理不僅能使分析過程順?biāo)?，也為后續(xù)的多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)記物識別和代謝途徑分析等奠定良好的基礎(chǔ)。

1.2 樣品分析 代謝組學(xué)研究離不開對復(fù)雜樣品的儀器分析，經(jīng)典的分析方法有核磁共振波譜分析(NMR)和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，以及多級質(zhì)譜聯(lián)用的分析技術(shù)等。NMR能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品的非破壞性、非選擇性分析，檢測盡可能多的化合物，但存在靈敏度低、分辨率不高的缺點，常常導(dǎo)致高豐度分析物掩蓋低豐度分析物的情況[10]。GC/MS技術(shù)因其分辨率高、靈敏度好，且有標(biāo)準(zhǔn)譜庫供比對，方便對代謝物進行定性的特點，在代謝組學(xué)分析技術(shù)中占有一席之地，尤其是微生物代謝組學(xué)和植物代謝組學(xué)。但GC/MS技術(shù)也有其局限性，主要是氣相色譜分析對象是揮發(fā)性代謝物，而難揮發(fā)的大部分代謝物信息不能直接獲得，需要借助復(fù)雜的衍生化處理手段[11]。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，LC /MS技術(shù)因其具有前處理簡單，適用于大部分代謝物的優(yōu)勢而逐漸被廣泛地用于代謝組學(xué)研究中[12]。代謝組學(xué)研究對象具有種類繁多，理化性質(zhì)差異大，濃度范圍分布廣的特點，要對它們進行無偏向的全面分析，單一的分離分析手段難以勝任，因此聯(lián)合使用多種分析方法也成為新的趨勢[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理 代謝組學(xué)在樣品分析過程中產(chǎn)生海量的多維原始數(shù)據(jù)，處理、分析和管理這些數(shù)據(jù)需要專門的數(shù)學(xué)、統(tǒng)計和信息學(xué)知識和工具。經(jīng)過多年的發(fā)展，代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)庫技術(shù)、統(tǒng)計分析方法也日趨成熟和完善[14]。首先需要對各分析方法所得的原始數(shù)據(jù)進行處理，主要是提取、峰對齊、去噪等處理之后得到可用于代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)格式。之后為了挖掘代謝物信息，需要借助統(tǒng)計分析手段對兩類或多類變量進行判別分類，最經(jīng)典的統(tǒng)計分析方法為模式識別技術(shù)。常用的模式識別技術(shù)包括無監(jiān)督(unsupervised)學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督(supervised)學(xué)習(xí)方法兩類。無監(jiān)督的模式識別方法直接將具有相似特征的樣本進行分類，找出分類信息與原始信息的差別，主要包括主成分分析(PCA)、簇類分析(HCA)等；有監(jiān)督模式識別方法利用多參數(shù)模型對未知數(shù)據(jù)進行辨識、歸類和預(yù)測，建立模型時有可供學(xué)習(xí)的樣本，主要包括偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANNs)。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理的意義在于將龐大的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成有意義的生物學(xué)結(jié)果，實現(xiàn)對樣品的分類或者尋找生物標(biāo)志物。

2 代謝組學(xué)在中獸藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景分析

代謝組學(xué)研究系統(tǒng)生化譜和功能調(diào)節(jié)的整體效果，這與中藥作用的整體觀念一致，適于解決中藥難以認識的整體效應(yīng)和作用機理等多方面的問題[15]。同樣的道理，也可以借助代謝組學(xué)的整體性研究思路和技術(shù)手段來研究獸用中藥，尤其是某些作用機制仍不明確，毒理研究仍不透徹，質(zhì)量控制還不到位的中獸藥。

2.1 代謝組學(xué)在闡明中獸藥作用機制中的應(yīng)用前景分析 中獸藥大部分是復(fù)方制劑，通過多組分發(fā)揮多途徑、多靶點的協(xié)同作用，最終達到整體調(diào)節(jié)動物機體的目的，因此對其作用機制的闡述存在一定的難度。而代謝組學(xué)是研究藥物引起機體內(nèi)源性代謝物的全局和系統(tǒng)性變化，直接反映體內(nèi)生化過程和狀態(tài)的整體變化，采用代謝組學(xué)的技術(shù)和研究思路可系統(tǒng)的解釋和評價多組分中獸藥復(fù)方的作用機制和療效。

華永麗博士[16]采用代謝組學(xué)研究策略，以當(dāng)歸揮發(fā)油為研究對象，建立大鼠炎癥模型，進行了當(dāng)歸揮發(fā)油的抗炎機制研究，從機體整體水平揭示其抗炎的機理，分析了當(dāng)歸揮發(fā)油抗炎相關(guān)的代謝物、代謝通路以及與當(dāng)歸揮發(fā)油抗炎作用相關(guān)的細胞因子之間的關(guān)系：采用GC-MS測定空白對照組(KB)、LPS炎癥模型組、不同濃度當(dāng)歸揮發(fā)油干預(yù)組的血漿、肝組織、肺組織、尿液中代謝物；應(yīng)用PCA、PLS-DA對各組不同組織的GC-MS數(shù)據(jù)進行分析，不同模型組得到完全分離；通過重要變量投影因子(VIP)及非參數(shù)檢驗篩選出各組織中的差異代謝物；運用代謝組學(xué)途徑分析(MetPA)數(shù)據(jù)庫對差異代謝物的代謝途徑進行分析；采用MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建各組不同組織篩選出的所有差異代謝物的相關(guān)代謝通路，找出與LPS致炎及當(dāng)歸揮發(fā)油干預(yù)作用有密切相關(guān)性的代謝通路；采用Matlab軟件對所有差異代謝物及其KB、LPS炎癥模型組、不同濃度當(dāng)歸揮發(fā)油干預(yù)組進行熱點聚類分析，所篩選的差異代謝可以表征各組；采用Spss軟件對所檢測到的差異代謝物與檢測的炎性因子、炎性介質(zhì)指標(biāo)進行相關(guān)性分析，篩選出琥珀酸、丙酮酸等七種可作為LPS致炎及當(dāng)歸揮發(fā)油抗炎的生物標(biāo)志物。

2.2 代謝組學(xué)在中獸藥毒理和安全性評價研究方面的應(yīng)用前景分析 隨著對用藥安全的重視程度越來越高，人們對中藥毒理與安全性評價的關(guān)注度也日益提高。中藥毒性成分復(fù)雜，致毒機制不明確，中藥安全性已是涉及中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化的重大科學(xué)問題[15]。謝燮等[17]以實驗大鼠為對象，分析其尿液代謝物組成的動態(tài)變化,考察人參的主要有效成分--人參總皂苷對大鼠機體尿液代謝譜的影響。結(jié)果顯示短期和長期服用人參皂苷均不會對正常大鼠尿液的代謝組造成非常顯著的影響。梁曉萍博士[18]采用UPLC/TOF-MS代謝組學(xué)方法研究了蟾酥對大鼠潛在的心臟急性毒性。結(jié)果表明蟾酥毒性對體內(nèi)代謝的干擾主要集中于脂質(zhì)代謝的相關(guān)途徑,從代謝層面上反映了蟾酥導(dǎo)致的心臟損傷,以及該損傷對機體代謝的影響。代謝組學(xué)在中藥毒理與安全性評價中的應(yīng)用主要集中在單味中藥，對中藥方劑的研究較少，胡中慧博士[19]利用1H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對蓮必治注射液毒性作用機制進行了推測。目前，針對中獸藥的毒理及安全性評價的代謝組學(xué)的相關(guān)研究鮮有報道，但中獸藥的安全性問題是涉及獸藥殘留和動物源性食品安全的重大問題，基于代謝組學(xué)已在中藥毒理及安全性評價研究中的良好基礎(chǔ)，其在中獸藥毒理及安全性評價中必將發(fā)揮重要作用，具有良好的研究前景。

2.3 代謝組學(xué)在中獸藥質(zhì)量控制方面的應(yīng)用前景分析 中藥的質(zhì)量控制研究一直是中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化、國際化進程的重要保障，中藥質(zhì)量控制的基礎(chǔ)與核心是中藥效應(yīng)物質(zhì)，即中藥及其復(fù)方中發(fā)揮作用的化學(xué)成分[20]。傳統(tǒng)的質(zhì)量控制手段包括指紋圖譜方法和主成分(或活性成分)定性定量方法，但這兩種方法均不能從整體上反映中藥的質(zhì)量，制約了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的合理性。中藥發(fā)揮作用靠的是多組分、多靶點協(xié)同作用，不僅是單一活性成分的作用，也不是多種活性成分的簡單相加，尤其中藥復(fù)方更是如此，因此，不能以化學(xué)藥品的量效關(guān)系模式來簡單控制中藥的質(zhì)量，而代謝組學(xué)的整體性研究思路與中藥質(zhì)量控制的整體性要求不謀而合，因此，代謝組學(xué)技術(shù)已成為中藥質(zhì)量控制研究的重要技術(shù)手段之一。向錚[21]采用代謝組學(xué)方法研究不同植物來源的莪術(shù)的質(zhì)量控制和評價方法，以我國較常用的中藥材莪術(shù)(包括溫莪術(shù)、蓬莪術(shù)及廣西莪術(shù))為研究對象，研究不同生長時期莪術(shù)的代謝物輪廓，結(jié)合PCA和PLS-DA等模式識別方法建立三種不同植物來源的莪術(shù)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，篩選了4個分類化學(xué)標(biāo)志物莪術(shù)酮、吉馬酮、莪術(shù)二酮及表莪術(shù)酮，并成功用于商品莪術(shù)藥材的來源和質(zhì)量控制。Lee DY等人[22]采用基于LC-QTOF/MS的代謝組學(xué)技術(shù)方法快速區(qū)分來源于韓中日三國的人參，并采用PCA和PLS-DA分析方法獲得區(qū)分不同來源人參的生物標(biāo)記物，并建立了質(zhì)量控制方法。除了對中藥材的鑒定，代謝組學(xué)在中藥質(zhì)量控制中還可與其他技術(shù)手段協(xié)同作用，實現(xiàn)對中藥質(zhì)量全方位，多角度，點面結(jié)合的監(jiān)控。李萍團隊[23]經(jīng)過不斷地探索和實踐，形成了從吸收、分布、靶向結(jié)合和代謝 4 個水平上闡明中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)，采用代謝指紋圖譜、生物指紋圖譜與多活性指標(biāo)成分定量分析相結(jié)合的中藥質(zhì)量控制體系。并將這一思路成功的用于包括金銀花、黃芪、當(dāng)歸、丹參、三七等中藥材、制劑和復(fù)方丹參片、當(dāng)歸補血湯、銀花甘草湯、丹七方等中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究中。

代謝組學(xué)技術(shù)手段已是國內(nèi)外進行中藥質(zhì)量控制研究的重要方法之一，將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到中獸藥質(zhì)量控制研究中，亦為一種新的選擇，打破常規(guī)思路，以整體性的思維模式進行中獸藥質(zhì)量控制研究，最終建立更加科學(xué)合理的中獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3 展 望

隨著分析技術(shù)、儀器工業(yè)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)的研究不斷完善，其在中藥研究領(lǐng)域必將發(fā)揮更重要的作用。遺憾的是，中獸藥研究還未能充分利用代謝組學(xué)這個研究利器，根據(jù)其在中藥領(lǐng)域已經(jīng)取得的進展，可以預(yù)測其在中獸藥作用機制研究，毒理及安全評價研究，質(zhì)量控制方面具有良好的應(yīng)用前景。

當(dāng)然，任何分析技術(shù)都有缺陷，代謝組學(xué)也不例外，未來其在中獸藥領(lǐng)域的發(fā)展也將面臨眾多挑戰(zhàn)，主要體現(xiàn)在：1)目前還沒有一種樣品處理技術(shù)和分析技術(shù)能同時實現(xiàn)對所有代謝物進行全面的定性和定量分析；2)如何將代謝組學(xué)獲得的海量數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成有生物學(xué)意義的指標(biāo)，科學(xué)合理的數(shù)據(jù)處理技術(shù)是關(guān)鍵；3)中獸藥多組分、多靶點、作用于多種目標(biāo)動物的復(fù)雜特點對代謝組學(xué)的發(fā)展提出了更高的要求。雖然現(xiàn)階段挑戰(zhàn)多，但機遇與挑戰(zhàn)并存，相信隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷完善，必將為中獸藥的發(fā)展提供更加廣闊的研究平臺，實現(xiàn)中獸藥的安全、有效、質(zhì)量可控，大力推動中獸藥現(xiàn)代化研究的步伐。

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