豬瘟病毒在宿主細(xì)胞中增殖與遺傳變異的研究進(jìn)展

孫駿翔，徐 璐，王 琴，張乾義

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，隸屬于黃病毒科瘟病毒屬。本屬主要成員還包括牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)、邊界病病毒(Border disease virus, BDV)等。瘟病毒不能在無脊椎動(dòng)物體內(nèi)增殖，而且所有成員不通過節(jié)肢動(dòng)物傳播[1]。瘟病毒在細(xì)胞漿內(nèi)增殖并發(fā)育成熟。在宿主細(xì)胞中的增殖主要包括吸附宿主細(xì)胞及其內(nèi)化、基因復(fù)制表達(dá)、病毒粒子的裝配及釋放等過程。而目前人們針對(duì)瘟病毒屬在宿主體內(nèi)增殖及遺傳變異過程知之甚少，因此就瘟病毒屬特別是豬瘟病毒的增殖過程及遺傳變異情況進(jìn)行了論述。

血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，CSFV、BVDV和BDV之間在抗原上存在很大相似性，有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)，肯定了它們之間存在著很近的親緣關(guān)系。人們?cè)谠缙诎凑账拗鲃?dòng)物的種類來區(qū)別瘟病毒，例如從牛中分離出的瘟病毒被命名為BVDV，而從豬中分離的則被稱為CSFV。實(shí)際上這三種病毒能在彼此的易感宿主中傳播，例如豬可以被BVDV或BDV自然感染，而在動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)中BVDV能感染豬和羊，BDV能感染牛和豬。

1 病毒的增殖

1.1 病毒的吸附穿入及內(nèi)化 OIE/國家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用可視化原位雜交技術(shù)(ViewRNA ISH)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，CSFV在感染細(xì)胞0.5 h以內(nèi)吸附進(jìn)入靶細(xì)胞[2]。病毒吸附效率與環(huán)境pH有關(guān)，經(jīng)過NH4Cl處理的細(xì)胞，CSFV感染效率會(huì)發(fā)生明顯下降，說明CSFV建立感染的過程有可能依賴于酸性環(huán)境[3]。病毒的吸附內(nèi)化是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，除了與pH有關(guān)外，病毒蛋白及其受體同樣發(fā)揮著重要作用。瘟病毒在吸附和穿入宿主細(xì)胞時(shí)，主要由Erns、E1、E2三種囊膜糖蛋白與宿主細(xì)胞受體蛋白之間相互作用介導(dǎo)的內(nèi)吞來完成。囊膜蛋白的糖基化對(duì)病毒侵染細(xì)胞有重要作用，應(yīng)用糖基化抑制劑抑制Erns、E1、E2三種囊膜糖蛋白的糖基合成和修飾，可以有效地降低病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力[4]。Erns蛋白的受體是硫酸乙酰肝素(HS)。Erns蛋白中相應(yīng)氨基酸的改變導(dǎo)致其與HS結(jié)合能力的差異，從而引起不同病毒毒株在體內(nèi)和體外感染宿主細(xì)胞的能力差異[5]。但Erns對(duì)于病毒吸附宿主細(xì)胞卻不是必須的，有研究表明在一個(gè)以假病毒為載體的試驗(yàn)中，E1和E2即可滿足病毒的穿入需要[6]，目前針對(duì)E2蛋白的受體尚無明確定論，免疫共沉淀試驗(yàn)證明豬瘟病毒E2蛋白能夠沉淀PK15細(xì)胞表面的CD46分子[7]，說明CD46蛋白與豬瘟病毒E2蛋白之間存在相互作用，提示CD46蛋白可能是豬瘟病毒吸附過程中所必需的受體蛋白之一。

瘟病毒屬同其他有囊膜病毒類似，也是通過胞吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞。以CSFV為例，CSFV通過囊膜蛋白與受體結(jié)合，再經(jīng)包涵素依賴的受體介導(dǎo)的胞吞途徑內(nèi)化。糖蛋白與受體結(jié)合后，激活或者暴露其相應(yīng)的內(nèi)吞信號(hào)，內(nèi)吞信號(hào)能介導(dǎo)它們進(jìn)入包被小窩，隨后胞膜局部磷脂組成改變，從而使胞膜彎曲。一旦包被小窩向內(nèi)凹陷到一定程度，包被小窩從細(xì)胞膜處分離從而形成胞吞囊泡。胞吞囊泡進(jìn)入細(xì)胞漿后，在突觸小泡磷酸酶(Synaptojanin)、輔助蛋白(Auxilin)等蛋白共同作用下脫包被[8]，隨后在包涵素等參與下與質(zhì)膜附近的早期內(nèi)吞體融合，內(nèi)吞體中的酸性環(huán)境可以促使病毒的穿透，完成病毒的侵入過程。

1.2 病毒基因翻譯與復(fù)制 病毒侵入宿主細(xì)胞后，CSFV基因組從核衣殼中釋放后，單股正鏈RNA直接作為mRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，翻譯成一個(gè)由3,898個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，經(jīng)過蛋白酶作用，被裂解成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白C、Erns、E1、E2)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。各蛋白的排列順序從N端到C端依次為NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH?，F(xiàn)已明確了CSFV大部分基因片段的分子結(jié)構(gòu)和功能。病毒蛋白與宿主蛋白相互作用，共同完成病毒的翻譯與復(fù)制。

CSFV RNA復(fù)制是在細(xì)胞質(zhì)膜上進(jìn)行的，絲裂原激活的蛋白激酶激酶2(Mitogen-activated protein kinase kinase 2，MEK2)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signaling-regulation kinase,ERK)信號(hào)通路的重要激酶，ERK信號(hào)通路可以與JAK-STAT信號(hào)通路相互調(diào)節(jié)發(fā)揮INF-α的抗病毒作用。MEK2與E2蛋白互作可以下調(diào)JAK-STAT的信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)CSFV的復(fù)制[9]。OIE/國家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用可視化原位雜交(ViewISH)技術(shù)對(duì)感染細(xì)胞中CSFV RNA的定位研究中發(fā)現(xiàn)，感染早期病毒RNA不僅存在于細(xì)胞漿，細(xì)胞核內(nèi)也檢測到病毒RNA的存在，提示宿主細(xì)胞核對(duì)病毒復(fù)制有著某種作用[10]。已有文獻(xiàn)證明核不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonu-cleoprotein，hnRNPs)是存在于細(xì)胞核中的一類蛋白，參與病毒RNA的合成與加工。在CSFV感染誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究中也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中有4種hnRNPs的表達(dá)水平發(fā)生變化[11]，表明CSFV的復(fù)制同樣需要宿主細(xì)胞hnRNPs參與病毒RNA的合成與加工。NS3蛋白是核糖體切入位點(diǎn)結(jié)合蛋白，其RNA解旋酶活性可以增強(qiáng)核糖體切入位點(diǎn)內(nèi)翻譯和細(xì)胞翻譯，是CSFV基因復(fù)制不可或缺的蛋白基因[12]。NSSB與NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域作用既可以增強(qiáng)核糖體切入位點(diǎn)作用，也可以增強(qiáng)細(xì)胞的蛋白翻譯水平。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)C蛋白可以促進(jìn)由NS5B蛋白介導(dǎo)的RNA從頭合成途徑，且C蛋白與NS5B共表達(dá)可以增強(qiáng)NS5B蛋白的活性[13]。NS5B編碼的RdRp(RNA依賴性RNA聚合酶)是病毒復(fù)制酶的主要成分，與其他病毒蛋白及宿主細(xì)胞中的一些蛋白因子共同構(gòu)成病毒復(fù)制酶系統(tǒng)。CSFV的RdRp具有模板特異性，能復(fù)制病毒的RNA而不復(fù)制細(xì)胞的RNA。RdRp存在一段由12個(gè)氨基酸殘基組成的β-loop結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以調(diào)控RdRp準(zhǔn)確的從病毒RNA 3'末端起始RNA合成。RdRp與CSFV正鏈RNA的3'NTR上的復(fù)制起始位點(diǎn)結(jié)合，在宿主蛋白和其他蛋白的幫助下，按照引物非依賴從頭合成的機(jī)制，以正鏈RNA為模板起始病毒RNA的合成[14]。隨著負(fù)鏈RNA的延長，RdRp沿著模板到達(dá)5'NTR內(nèi)的復(fù)制起始識(shí)別位點(diǎn)，為合成第二條鏈做準(zhǔn)備。由于5'末端存在發(fā)卡結(jié)構(gòu)，RdRp到達(dá)5'末端后利用自身的核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性繼續(xù)延長正在合成的RNA鏈，然后采用copy-back機(jī)制折返[15]，開始以負(fù)鏈為模板進(jìn)行RNA的正鏈合成，連接處的單鏈部分隨后被水解。

CSFV、BVDV的5'NTR無甲基化的帽子結(jié)構(gòu)由360～386個(gè)核苷酸組成，有兩個(gè)復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)[16]。CSFV的3'NTR含有起始RNA合成的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等順式作用元件，因此在病毒復(fù)制中起著非常重要的調(diào)控作用。3'NTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，第一莖環(huán)及第一莖環(huán)和第二莖環(huán)之間的單鏈序列為復(fù)制起始的必需因子，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的改變可以調(diào)節(jié)病毒RNA的復(fù)制效率。

1.3 病毒的裝配與釋放 新合成的病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)組合成病毒顆粒的過程稱為裝配，而從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的過程為釋放。病毒的裝配是病毒復(fù)制增殖中的重要步驟，與大多數(shù)RNA病毒相似，CSFV的裝配也是在細(xì)胞質(zhì)中完成。對(duì)于單鏈RNA病毒來說，殼體是沿著基因組組裝的，組裝原則是RNA在殼體的位置直接由與之結(jié)合的外殼蛋白決定[17]。C蛋白是CSFV編碼的第一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，它在合成后不久即與基因組RNA結(jié)合包裝形成核衣殼。另外，C蛋白和宿主細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白IQGPA1(IQ domain GTPase—activating protein1)發(fā)生作用決定病毒從宿主細(xì)胞中釋放以及感染細(xì)胞過程中穿透細(xì)胞膜[18]。其余三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的二聚化可能在病毒裝配中有著重要作用[19]。病毒囊膜蛋白在細(xì)胞中的分布與數(shù)量在很大程度上決定了病毒成熟的部位。CSFV的囊膜蛋白在C-Erns-E1-E2前體的基礎(chǔ)上，由定位在宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上的信號(hào)肽酶、蛋白水解酶以及糖基化酶的作用下加工成熟的，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。成熟的病毒粒子常見于細(xì)胞質(zhì)中的無定型基質(zhì)的囊膜中，有時(shí)還可看到囊膜在質(zhì)膜處的開口以及周圍的無定型基質(zhì)和其中的成熟病毒,提示CSFV可能是通過這一特殊結(jié)構(gòu)向外釋放，且多數(shù)釋放的病毒依然吸附在無定型基質(zhì)中[20]。非結(jié)構(gòu)蛋白也在CSFV的裝配和釋放中發(fā)揮作用，瘟病毒的P7蛋白是病毒孔蛋白家庭中的成員[21]，可以通過寡聚化在膜上形成一個(gè)親水孔，進(jìn)而調(diào)節(jié)跨膜陽離子的通透性，這對(duì)病毒的釋放和成熟非常重要。與黃病毒和丙型肝炎病毒(HCV)相似，CSFV在完成出芽的過程中獲得病毒包膜。CSFV在體外細(xì)胞培養(yǎng)下，發(fā)現(xiàn)新釋放的病毒可以通過三種方式感染更多的細(xì)胞：一是感染細(xì)胞內(nèi)釋放的病毒粒子經(jīng)過培養(yǎng)液感染新的易感細(xì)胞；二是被感染細(xì)胞通過有絲分裂直接傳給子細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入抗豬瘟的抗血清不影響病毒感染滴度[22]；三是病毒通過細(xì)胞間橋在細(xì)胞之間傳播[23]，或者外泌小體可以介導(dǎo)CSFV在細(xì)胞間的傳遞，從而開始新的病毒復(fù)制周期。

2 病毒的遺傳變異

CSFV和BVDV的5'NTR是高度保守的[24]，而3'NTR則完全相反。CSFV、BVDV的5'NTR無甲基化的帽子結(jié)構(gòu)有多個(gè)AUG密碼子和一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，在病毒基因組復(fù)制及多聚蛋白表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。不同CSFV毒株的5'NTR同源性較高，這有助于CSFV分子流行病學(xué)的調(diào)查和研究；同樣，BVDV的5'UTR包含保守序列和高變序列，可以作為BVDV基因分型的依據(jù)[25]。陳銳等從基于5'NTR序列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析西部散養(yǎng)肉牛BVDV，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)散養(yǎng)肉牛感染的BVDV基因亞型有所不同[26]。CSFV的3'NTR含有起始RNA合成的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等順式作用元件，因此在病毒復(fù)制中起著非常重要的調(diào)控作用。比較豬瘟強(qiáng)毒株Shimen和疫苗株HCLV 的3'NTR二級(jí)結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)，疫苗株的3'NTR存在一個(gè)富含12bp的CTTTTTTCTTTT核苷酸結(jié)構(gòu)，而強(qiáng)毒株3'NTR則沒有這12個(gè)核苷酸的插入，研究表明，CSFV 3'NTR 插入12個(gè)核苷酸序列和病毒毒力的減弱有密切的關(guān)系[27]。這12個(gè)核苷酸的插入可能導(dǎo)致 3'NTR二級(jí)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，從而影響病毒 RNA 的合成。CSFV 3'NTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)毒復(fù)制和毒力有很大的影響，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括4個(gè)莖環(huán)，按逆時(shí)針方向依次為莖環(huán)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ[28]，莖環(huán)Ⅰ、Ⅱ較為穩(wěn)定，Shimen株等強(qiáng)毒株的復(fù)制起始識(shí)別位點(diǎn)位于莖環(huán)Ⅰ區(qū)域的右側(cè)，而C株復(fù)制起始的識(shí)別位點(diǎn)是在莖環(huán)Ⅰ頂端的兩側(cè)。莖環(huán)Ⅲ、Ⅳ位于3' NTR的高可變區(qū)，也是二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最大的區(qū)域，它的變化影響到病毒整個(gè)3'NTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步影響了CSFV RNA的復(fù)制。

病毒的變異主要源于其基因的突變和重組[29]，而瘟病毒屬成員均為RNA病毒，沒有RNA聚合酶的校對(duì)功能，因此病毒的變異率較高。已有報(bào)道證實(shí)我國存在同源重組的CSFV[30]。病毒一般通過重要抗原表位的變異，從而喪失與抗體的結(jié)合能力，導(dǎo)致毒株無法被機(jī)體免疫系統(tǒng)有效清除，造成持續(xù)感染。CSFV的 E2 蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體從而有效對(duì)抗病毒感染，所以E2基因的變異可能導(dǎo)致CSFV 流行毒株的免疫逃逸。通過對(duì)CSFV石門株不同代次E2基因主要抗原編碼區(qū)序列差異分析，證實(shí)CSFV在體內(nèi)及體外具有一定的遺傳穩(wěn)定性，不因宿主免疫系統(tǒng)的選擇壓力而發(fā)生明顯的遺傳變異[31]。CSFV E2蛋白有15個(gè)保守Cys 位點(diǎn)，其中位于N端的6個(gè)Cys 通過形成3對(duì)二硫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)的正確折疊以及特異性抗原決定簇形成起著重要作用。李玲偉研究發(fā)現(xiàn)了一株CSFV突變株，其737位Cys突變?yōu)锳rg，破壞B/C抗原區(qū)的空間結(jié)構(gòu)，該突變株不能與部分對(duì)B/C抗原區(qū)的單克隆抗體反應(yīng)，這一變異可能會(huì)影響疫苗的免疫效果[32]。E2基因是瘟病毒的主要保護(hù)性抗原編碼基因，在瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因中變異較大，代表著毒株的遺傳特性。采用國際公認(rèn)的利用E2基因序列進(jìn)行分型可以將CSFV分為3個(gè)基因型，11個(gè)基因亞型，即1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3和3.4亞型。Postel 等對(duì)歐洲33個(gè)CSFV分離毒株基因組5'-NTR-E2區(qū)段的約3580個(gè)核苷酸進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)E2全長基因編碼序列構(gòu)建的進(jìn)化樹更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[33]，并利用E2全長分析，將以前E2基因片段系統(tǒng)進(jìn)化分析鑒定的1.2亞型古巴CSFV流行毒株重新劃分為基因1.4亞型[34]。本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)近年來各地樣本檢測并使用E2全基因序列分析發(fā)現(xiàn)，豬瘟在我國流行毒株已從2.1型、2.2型、1.1型，變?yōu)?.1型、1.1型，且2.1亞型分布更為廣泛。

3 結(jié) 語

隨著NS3、Npro、E2等病毒蛋白質(zhì)功能的研究深入，人們對(duì)瘟病毒在體內(nèi)增殖過程的研究有了一定的進(jìn)展。而了解和監(jiān)控病毒的變異動(dòng)態(tài)，將為該病毒的防控或凈化提供有力的理論和技術(shù)支撐。本文通過論述瘟病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖過程及病毒蛋白和宿主蛋白在病毒吸附及內(nèi)化、基因復(fù)制表達(dá)、病毒粒子的裝配及釋放等過程中所發(fā)揮的作用，系統(tǒng)的闡述了瘟病毒在機(jī)體中的增殖特性及遺傳變異。但依然有許多問題亟待解決，如瘟病毒的內(nèi)化過程中需要的細(xì)胞受體、宿主細(xì)胞核是否在病毒復(fù)制過程中起作用、病毒裝配后具體是如何釋放到胞外等，人們對(duì)此依然知之甚少。近年來，得益于高通量測序的發(fā)展，采用文庫篩選法來篩選病毒的特異細(xì)胞受體逐步為研究者所青睞。文庫篩選法與免疫共沉淀等傳統(tǒng)篩選受體方法相比具有高容量的特點(diǎn)，可涵蓋全基因組，擺脫了傳統(tǒng)方法僅能篩選高豐度細(xì)胞受體的局限性。相信隨著科研人員對(duì)瘟病毒基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步探索，不但可以為研究病毒與宿主間的相互作用提供思路，也為CSFV受體的互作蛋白研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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