尼羅羅非魚Ikaros基因的克隆及表達(dá)分析

陳昆平 劉志剛 盧邁新 高風(fēng)英 張德鋒 可小麗曹建萌 朱華平 王 淼 衣萌萌

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380;2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

DNA結(jié)合蛋白Ikaros家族是具有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子, 它包括Ikaros、Aiolos、Helios、Ecos和Pegasus等5個(gè)成員, 它們對(duì)淋巴細(xì)胞及其他造血細(xì)胞的早期發(fā)生和發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[1]。其中, 由Ikaros基因編碼的Ikaros是preBCR、Notch、MAPK等多個(gè)信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,通過FOXO1、HuD、ETS1等調(diào)控因子的相互作用來調(diào)控大量與淋巴細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的下游基因的表達(dá), 對(duì)于淋巴細(xì)胞的正確發(fā)育及其免疫功能的發(fā)揮具有重要作用[2]。研究表明, 當(dāng)小鼠(Mus musculus)的Ikaros基因發(fā)生突變時(shí), 多能造血干細(xì)胞不能分化為淋巴樣祖細(xì)胞, 其體內(nèi)將缺失B細(xì)胞、NK細(xì)胞、外周淋巴結(jié)和早期的T細(xì)胞[3,4]。Winandy和Payne等[5,6]認(rèn)為Ikaros基因是一個(gè)腫瘤抑制基因,Ikaros活力的喪失會(huì)導(dǎo)致前B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性狀態(tài),腫瘤發(fā)生的概率大大增加。在人類(Homo sapiens)中,Ikaros基因的缺失及功能性突變?cè)诩毙粤馨图?xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用, 而且與惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7—9]。

羅非魚(Tilapia)是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)重點(diǎn)推廣養(yǎng)殖的對(duì)象, 被譽(yù)為未來動(dòng)物性蛋白質(zhì)主要來源之一, 因具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、繁殖力高和食性廣等優(yōu)點(diǎn), 已被世界各地廣泛引種與養(yǎng)殖[10]。但近年來由于羅非魚鏈球菌病的頻繁發(fā)生與流行, 給羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10,11]。開展羅非魚免疫相關(guān)基因的研究可為探索羅非魚免疫防御機(jī)制及抗病品種培育奠定基礎(chǔ), 對(duì)羅非魚病害防治具有重要意義。目前有關(guān)羅非魚免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究還比較薄弱, 羅非魚Ikaros基因的研究尚未見報(bào)道。開展羅非魚Ikaros基因結(jié)構(gòu)、功能及免疫應(yīng)答特性的研究, 有助于全面了解羅非魚免疫系統(tǒng)防御特點(diǎn)以及進(jìn)一步揭示免疫轉(zhuǎn)錄因子在抵御病原感染中發(fā)揮的調(diào)控作用。本研究利用RT-PCR和RACE等技術(shù), 對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus, GIFT strain)Ikaros基因進(jìn)行了克隆, 并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Ikaros基因在尼羅羅非魚各個(gè)組織中的表達(dá)情況及其在人工感染無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)后免疫相關(guān)組織中的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚: 尼羅羅非魚來自廣東羅非魚良種場(chǎng), 體質(zhì)量為30—50 g, 在珠江水產(chǎn)研究所的池塘網(wǎng)箱中暫養(yǎng)一周后用于試驗(yàn)。

菌株: 無乳鏈球菌菌株WC1535由本實(shí)驗(yàn)室分離保存, 為Ⅰa型強(qiáng)毒株。

實(shí)驗(yàn)試劑:Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T載體和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司; RNA提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司; DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;PowerUpTMSYBR?Green Master Mix試劑盒購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司; SMARTTMRACR cDNA Amplification kit和Genome WalkerTMUniversal Kit購自美國(guó)Clontech公司; 常規(guī)PCR所用的TaqDNA polymerase、dNTP mixture和Buffer for Tap DNA Polymerase購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

尼羅羅非魚Ikaros基因組DNA序列及其cDNA序列的克隆在無菌條件下, 解剖尼羅羅非魚取胸腺組織, 采用Magen High Pure Universal RNA Kit(Magen)試劑盒提取總RNA, 步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行, 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性, 并用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。取1 μg胸腺RNA, 采用Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用TIAN-amp Marine Animals DNA Kit (TIANGEN)試劑盒提取尼羅羅非魚的尾鰭基因組DNA。

參照尼羅羅非魚IkaroscDNA的預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)為: XM_005473805)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增和RACE所需要的引物(表 1), 本實(shí)驗(yàn)所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以胸腺組織cDNA為模板, PCR擴(kuò)增Ikarosc DNA序列片段。Ikaros基因cDNA 5′末端和3′末端的擴(kuò)增按照SMARTTMRACR cDNA Amplification kit (TaKaRa)的操作手冊(cè)進(jìn)行。參照尼羅羅非魚Ikaros基因的預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)為: NC_022211)和已獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物(表 1), 以尾鰭組織基因組DNA為模板, PCR擴(kuò)增Ikaros基因組DNA序列片段。Ikaros基因5′側(cè)翼序列采用Genome WalkerTMUniversal Kit(Clontech)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物膠回收純化后與載體pMD19-T連接, 轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 陽性單克隆送至Invitrogen公司測(cè)序, 通過序列拼接獲得IkaroscDNA序列和基因組DNA序列全長(zhǎng)。

表 1 用于尼羅羅非魚Ikaros基因克隆和表達(dá)的主要引物及其序列Tab. 1 Primers used for charactering the Ikaros gene in O. niloticus

尼羅羅非魚Ikaros基因的表達(dá)分析在無菌條件下, 解剖3尾健康尼羅羅非魚取血液、胸腺、脾臟、頭腎、鰓、心臟、腦、腸、肌肉、皮膚和肝臟等11個(gè)組織, 按照1.1中方法提取各組織的總RNA, 并取1 μg RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以EF-1α基因作為熒光定量PCR的內(nèi)參基因, 用于擴(kuò)增的引物為EF-1α sf2和EF-1α sr2; 在Ikaros6種mRNA剪接異構(gòu)體的共有序列中設(shè)計(jì)熒光定量引物(Ik-Q852F和Ik-Q1019R), 引物序列詳見表 1, 按照1.1中方法進(jìn)行目的片段的克隆, 將重組質(zhì)粒按10倍梯度稀釋為8個(gè)濃度梯度, 并將其作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。每個(gè)cDNA樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù), 反應(yīng)體系按照SYBR Green Mix (ABI)試劑盒的說明書進(jìn)行配制,使用ABI Step One Plus熒光定量?jī)x檢測(cè)Ikaros基因在各組織中的表達(dá)水平。qRT-PCR檢測(cè)的結(jié)果使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 采用2-ΔΔCt法計(jì)算單個(gè)樣品中Ikaros基因的相對(duì)表達(dá)量, 并利用SPPS17.0軟件中單因素方差分析進(jìn)行Ikaros基因表達(dá)水平的差異性分析,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后Ikaros基因在各組織中的表達(dá)變化將無乳鏈球菌種接種于血平板, 30℃培養(yǎng)16h后用PBS緩沖液稀釋菌體配置成濃度分別為5×105、1×106、5×106、1×107和5×107CFU/mL的菌液。將不同濃度的菌液分別注射于尼羅羅非魚腹腔中, 每組30尾, 每尾100 μL, 對(duì)照組注射等量PBS緩沖液, 獲得半致死濃度為5×106CFU/mL。將個(gè)體大小相近的150尾尼羅羅非魚分別置于5個(gè)體積為0.3 m3的魚缸中, 每缸30尾魚,水溫控制為(31±0.5)℃, 每天正常投喂2次, 馴養(yǎng)1周后以半致死濃度的無乳鏈球菌菌液進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。其中, 3個(gè)魚缸中的尼羅羅非魚設(shè)置為無乳鏈球菌感染組, 每尾腹腔注射100 μL無乳鏈球菌菌液, 另外2個(gè)魚缸中的尼羅羅非魚腹腔注射100 μL PBS緩沖液, 作為對(duì)照組。在0、8h、24h、48h、72h、120h、192h和288h共8個(gè)時(shí)間點(diǎn), 分別收集無乳鏈球菌感染組和PBS對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)3尾魚的血液、胸腺、頭腎和脾臟4種組織, 按1.3中建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)Ikaros基因在各組織中的表達(dá)變化。

生物信息學(xué)分析基因測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN和NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast等軟件進(jìn)行比對(duì)分析,蛋白理化性質(zhì)利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析, 信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),跨膜區(qū)分析使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), 疏水性分析使用Ex-PASy ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/), 糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/), 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/), 蛋白結(jié)構(gòu)域分析采用Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/), 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與分析采用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/workspace/)和Insight II軟件, 利用DNAstar和BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì), 利用MEGA5.05軟件中的鄰位相接法(Neighborjoining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 尼羅羅非魚Ikaros的cDNA序列及其特征

本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚IkaroscDNA進(jìn)行了克隆, 發(fā)現(xiàn)該基因具有6種不同的mRNA剪接異構(gòu)體, 分別為Ikaros-1、Ikaros-2、Ikaros-3、Ikaros-4、Ikaros-5和Ikaros-6, 其cDNA序列已經(jīng)提交到GenBank, 登錄號(hào)分別為KY825170、KY825171、KY825172、KY825173、KY825174和KY825175, 序列組分及其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)包括cDNA全長(zhǎng)(Full length cDNA, FLC)、5′非翻譯區(qū)(Untranslated region, UTR)、3′UTR、開放閱讀框(Open reading frame, ORF)、氨基酸(Amino acid, AA)、蛋白質(zhì)分子量(Protein molecular weight, Mr)和等電點(diǎn)(Isoelectric point, pI)的分析如表 2所示。使用TMHMM、Expasy和SignalP生物軟件對(duì)Ikaros基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均無疏水區(qū)域、無跨膜區(qū)域和無信號(hào)肽。利用NetPhos 3.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server生物軟件對(duì)Ikaros-1編碼的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列有46個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、18個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)以及2個(gè)糖基化位點(diǎn), 分別為39NASA和195NGSQ。

2.2 尼羅羅非魚Ikaros的基因組DNA序列及其mRNA剪接異構(gòu)體

通過PCR和Genome walking技術(shù)克隆獲得Ikaros的基因組DNA (GenBank登錄號(hào): KY825169),結(jié)果顯示該序列全長(zhǎng)為20454 bp, 包括3721 bp的5′側(cè)翼序列、8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子, 且連接處均符合GT-AG規(guī)律。對(duì)Ikaros6種不同的mRNA剪接異構(gòu)體進(jìn)行比對(duì)分析, 發(fā)現(xiàn)Ikaros-1和Ikaros-2包含8個(gè)外顯子,Ikaros-3缺失第7外顯子,Ikaros-4和Ikaros-5缺失第4外顯子,Ikaros-6缺失了第4和第7外顯子, 而Ikaros-2和Ikaros-5則分別在第7外顯子的5′末端比Ikaros-1和Ikaros-4少3個(gè)堿基(TAG), 從該結(jié)果可看出Ikaros基因的第4和第7外顯子為可變剪接外顯子, 且第7外顯子的剪接位置可發(fā)生在其頭3個(gè)堿基之后(圖1)。

2.3 尼羅羅非魚Ikaros蛋白的結(jié)構(gòu)分析

Smart預(yù)測(cè)尼羅羅非魚Ikaros蛋白的結(jié)構(gòu)域, 結(jié)果顯示Ikaros-1、Ikaros-2和Ikaros-3編碼的蛋白質(zhì)異形體(Ik1、Ik2和Ik3)均具有6個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc finger domains, ZnFs), 其中4個(gè)ZnFs位于N端, 由Ikaros基因的4—6外顯子編碼, 另外2個(gè)Zn-Fs位于C端, 由Ikaros基因的第8外顯子編碼, 而Ikaros-4、Ikaros-5和Ikaros-6編碼的蛋白質(zhì)異形體(Ik4、Ik5和Ik6)由于第4外顯子的缺失而只獲得了5個(gè)保守的ZnFs, 其中N端有3個(gè), C端有2個(gè)(圖2)。使用SWISS-MODEL工具對(duì)Ikaros蛋白序列進(jìn)行同源建模, 同源性分析發(fā)現(xiàn)在含有ZnFs的序列中有相似的同源蛋白, 其中含有N端4個(gè)ZnFs的序列(位于Ikaros氨基酸序列的第205—340位置)與小鼠Zfp29基因編碼的Aart[PDB code: 2i13A]同源性較高, 為41.38%, 而含有C端2個(gè)ZnFs的序列(位于Ikaros氨基酸序列的第554—619位置)與人ZBTB43基因編碼的Zinc finger protein 297B [PDB code:2cshA]同源性較高, 為33.33%。通過Alignment mode進(jìn)行人工聯(lián)配, 構(gòu)建Ikaros的三維空間結(jié)構(gòu), 結(jié)果如圖3所示。Ikaros蛋白N端的4個(gè)ZnFs由4個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊片組成, C端ZnFs由2個(gè)α螺旋和4個(gè)β折疊片組成, 其中在每個(gè)α螺旋和2股反向平行的β折疊片之間均含有1個(gè)鋅離子, 在鋅離子的結(jié)合下, 這三個(gè)肽段可緊密折疊形成一種具有“手指”形狀的ββα結(jié)構(gòu), 即鋅指結(jié)構(gòu)。

表 2 尼羅羅非魚Ikaros基因的序列組分及其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)Tab. 2 The sequence component and protein physicochemical properties of Ikaros gene from O. niloticus

圖1 尼羅羅非魚Ikaros基因結(jié)構(gòu)模式圖Fig. 1 The Ikaros gene structures of O. niloticus

2.4 尼羅羅非魚Ikaros的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將尼羅羅非魚Ikaros-1編碼的氨基酸序列與大黃魚(Larimichthys crocea)、日本青鳉(Oryzias latipes)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、大西洋鮭(Salmo salar)、鯉(Cyprinus carpio)、斑點(diǎn)叉尾鲙(Ictalurus punctatus)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、雞(Gallus gallus)、小鼠、牛(Bos taurus)和人的Ikaros氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì), 其同源性分別為93.7%、93.2%、89.6%、87.0%、79.0%、74.0%、70.6%、63.4%、67.0%、64.3%、60.7%和64.0%。對(duì)上述物種的Ikaros蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn), 尼羅羅非魚與其他魚類、哺乳類和兩棲類一樣, 均具有6個(gè)典型的ZnFs, 且不同物種的ZnFs高度保守, 僅有個(gè)別氨基酸存在差異。利用MEGA5.05軟件對(duì)尼羅羅非魚Ikaros6種mRNA剪接異構(gòu)體編碼的氨基酸序列與其他23個(gè)不同物種的Ikaros氨基酸序列按鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從圖中可以看出, 硬骨魚類的Ikaros聚為一簇, 其中尼羅羅非魚與其他慈鯛科魚類親緣關(guān)系最近, 其次是鱸形目、鲀形目、鳉形目魚類。兩棲類、鳥類、哺乳類動(dòng)物Ikaros聚為另一簇。軟骨魚類鰩(Raja eglanteria)和無頜類七鰓鰻(Lampetra japonicum)的Ikaros與上述物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 分別單獨(dú)聚為一支。

圖2 尼羅羅非魚Ikaros蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 2 Prediction of conserved domain in Ikaros protein of O. niloticus

圖3 尼羅羅非魚Ikaros鋅指結(jié)構(gòu)域空間結(jié)構(gòu)模擬Fig. 3 The predicted three-dimensional space structure of Ikaros ZnFs from O. niloticus

圖4 基于不同物種Ikaros氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ法)Fig. 4 Phylogenetic tree of Ikaros in different species based on NJ method

圖5 Ikaros基因在尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)Fig. 5 Relative expression of Ikaros gene in different tissues of O. niloticus

2.5 Ikaros基因在健康尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)特征

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Ikaros基因在健康尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,Ikaros基因在被檢測(cè)的血液、胸腺和脾臟等11個(gè)組織中均有表達(dá)(圖5)。其中血液和胸腺的表達(dá)量最高, 均顯著高于其他組織器官, 脾臟和頭腎也有較高的表達(dá)水平, 而在鰓、心臟、腦、腸、肌肉、皮膚和肝臟的表達(dá)水平較低。

2.6 感染無乳鏈球菌后Ikaros基因在尼羅羅非魚組織中的表達(dá)變化情況

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的尼羅羅非魚血液、胸腺、頭腎、脾臟組織中Ikaros基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比, 感染無乳鏈球菌后血液、胸腺、頭腎、脾臟組織中Ikaros基因均上調(diào)表達(dá), 且其表達(dá)特征相似, 均在48h達(dá)到峰值并顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)(圖6)。

3 討論

3.1 尼羅羅非魚Ikaros基因序列特征及分析

本實(shí)驗(yàn)獲得了尼羅羅非魚IkaroscDNA及基因組DNA的全長(zhǎng)序列, 發(fā)現(xiàn)該基因有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子, 且連接處均符合GT-AG規(guī)律, 其中第4外顯子和第7外顯子存在跳躍現(xiàn)象, 即在mRNA剪接過程中這2個(gè)外顯子可能會(huì)被剪接或者被保留, 而第6內(nèi)含子在3′末端存在2個(gè)相鄰的剪切信號(hào)(AGTAG),這可能會(huì)造成第7外顯子在剪接過程發(fā)生剪切位點(diǎn)偏移的現(xiàn)象(圖1)。Hoskins等[12]研究表明, 外顯子內(nèi)部的剪接增強(qiáng)子(Exon splicing enhancer, ESE)與在RNA剪接中起調(diào)控作用的SR蛋白的作用模式可能是出現(xiàn)外顯子跳躍現(xiàn)象的主要原因, 當(dāng)ESE序列發(fā)生突變時(shí), ESE將不能與SR蛋白結(jié)合, 導(dǎo)致該外顯子在剪接過程中被跳過。而關(guān)于剪切位點(diǎn)偏移現(xiàn)象的發(fā)生是隨機(jī)的還是受相關(guān)分子的調(diào)控以及它在調(diào)節(jié)基因表達(dá)過程中是否具有特別的生理意義目前還不清楚。

Ikaros基因的可變剪接現(xiàn)象普遍存在于脊椎動(dòng)物中, 而且它們的可變剪接方式基本相同[13—20], 但不同物種IkarosmRNA剪接異構(gòu)體的數(shù)量卻不盡相同, 目前已發(fā)現(xiàn)在人類[8]中有13種, 斑馬魚[19](Danio rerio)有6種, 虹鱒[16](Oncorhynchus mykiss)有4種, 本研究在尼羅羅非魚中發(fā)現(xiàn)了6種?？勺兗艚訕O大地增加了真核生物基因表達(dá)的復(fù)雜程度和蛋白質(zhì)功能的多樣性, 其普遍存在于脊椎動(dòng)物中, 在多外顯子人類基因中的比例更是高達(dá)92%—94%[21]。因此,Ikaros基因的多種mRNA剪接異構(gòu)體也暗示著該基因在功能上的多樣性。在人類中, Ik1和Ik2參與造血干細(xì)胞的早期發(fā)生和發(fā)育, 并能有效抑制癌細(xì)胞和腫瘤的發(fā)生; Ik4、Ik6、Ik7和Ik8是一種顯性負(fù)亞型, 其異常表達(dá)與急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān); 而關(guān)于其他蛋白質(zhì)異形體的功能目前還不清楚, 有待進(jìn)一步研究[8,22,23]。

圖6 無乳鏈球菌感染后Ikaros基因在尼羅羅非魚胸腺、頭腎、脾臟及血液中的表達(dá)情況Fig. 6 Expression profile of Ikaros gene in the thymus, head kidney, spleen and blood of O. niloticus after infection with Streptococcus agalactiae

3.2 尼羅羅非魚Ikaros同源比較及結(jié)構(gòu)域分析

Ikaros廣泛存在于各類脊椎動(dòng)物中, 它們均具有4個(gè)N端ZnFs和2個(gè)C端ZnFs, 而且不同物種之間的ZnFs在氨基酸序列上僅有幾個(gè)氨基酸殘基不同,表明Ikaros的ZnFs在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的保守性。但由于編碼N端ZnFs的外顯子在可變剪接過程中不同程度缺失, 因此不同Ikaros蛋白質(zhì)異形體的N端ZnFs數(shù)量不盡相同, 該現(xiàn)象普遍存在于各物種中[13—20]。研究表明, N端ZnFs數(shù)量在3個(gè)及以上的Ikaros蛋白質(zhì)異形體可與目標(biāo)基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域以高親和力結(jié)合, 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用; N端Zn-Fs數(shù)量少于3個(gè)的Ikaros蛋白質(zhì)異形體則不能與DNA結(jié)合, 而是通過顯性負(fù)調(diào)控的方法抑制Ikaros的功能[24,25]。然而, 尼羅羅非魚6個(gè)Ikaros蛋白質(zhì)異形體的N端ZnFs數(shù)量均在3個(gè)以上, 表明它們均是具有DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子。C端的ZnFs相對(duì)保守, 存在于所有Ikaros蛋白質(zhì)異形體和家族其他成員中。研究表明, Ikaros同源蛋白之間可通過C端ZnFs的相互作用形成同源或異源二聚體, 而這些不同組合的二聚體實(shí)質(zhì)上代表的是一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 對(duì)Ikaros家族蛋白的DNA結(jié)合活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面均具有重要的作用[26,27]。Ikaros作為許多信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其N端ZnFs和C端ZnFs在信號(hào)通路的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。研究表明, 當(dāng)小鼠敲除Ikaros基因編碼C端兩個(gè)ZnFs的序列時(shí), 淋巴系統(tǒng)的發(fā)育表現(xiàn)異常,造血干細(xì)胞的活性嚴(yán)重抑制, T、B淋巴細(xì)胞也沒有產(chǎn)生[28]; 當(dāng)敲除小鼠Ikaros基因編碼N端兩個(gè)Zn-Fs的序列時(shí), 發(fā)現(xiàn)成熟T細(xì)胞和NK細(xì)胞的發(fā)育被抑制, 導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[3,29]。

3.3 尼羅羅非魚Ikaros基因的表達(dá)特征

為了揭示Ikaros基因在尼羅羅非魚各組織中的表達(dá)情況, 本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Ikaros6種mRNA剪接異構(gòu)體的總表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果表明Ikaros基因在尼羅羅非魚11個(gè)被檢測(cè)的組織中均有表達(dá)(圖5), 其中在血液中的表達(dá)量最高, 其次為胸腺、脾臟和頭腎, 在其他組織中的表達(dá)量較低。Ikaros基因在其他魚類和無頜類中均具有廣泛的組織表達(dá)模式, 但在不同組織的表達(dá)水平卻表現(xiàn)出一定的差異, 如斑馬魚[19]Ikaros基因在胸腺和前腎組織中具有較高的表達(dá)水平, 在中腎、脾、心臟、腸、大腦以及精巢中均檢測(cè)到了不同程度的表達(dá); 半滑舌鰨[20]Ikaros基因在胸腺、脾以及肝臟中表達(dá)量較高, 在腎臟、精巢和心臟中也有一定量的表達(dá), 而在腸、皮膚以及鰓中表達(dá)量很低; 七鰓鰻[18](Lampetra japonicum)Ikaros基因在精巢和卵巢中表達(dá)量最高, 其次是腎臟、腸、肝臟、鰓和血液。在哺乳動(dòng)物人類和小鼠中,Ikaros基因主要表達(dá)于造血干細(xì)胞、所有的淋巴細(xì)胞及部分髓系細(xì)胞中, 因此在含有大量造血干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的血液、胸腺等免疫組織或器官中具有較高的Ikaros表達(dá)量[2]。上述研究顯示,Ikaros基因在不同物種中的表達(dá)模式雖不盡相同, 但其在胸腺、頭腎、脾臟等主要免疫器官中高表達(dá), 反映了該基因具有重要的免疫功能。

目前, 有關(guān)魚類Ikaros在免疫應(yīng)答中作用的研究較少, 僅在半滑舌鰨[20]中開展了免疫LPS和LTA后的Ikaros應(yīng)答研究, 結(jié)果顯示在經(jīng)過LPS或LTA處理的頭腎巨噬細(xì)胞中,Ikaros基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。這表明Ikaros在巨噬細(xì)胞中具有特異性表達(dá), 為重要的免疫相關(guān)因子, 受病原相關(guān)分子模式調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn), 尼羅羅非魚在人工感染無乳鏈球菌后, 血液、胸腺、頭腎和脾臟中Ikaros基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào), 并在48h達(dá)到峰值。因此, 推測(cè)尼羅羅非魚Ikaros參與了調(diào)控魚體抵御外界病原微生物的免疫應(yīng)答反應(yīng), 是一種重要的免疫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

有研究表明, 不同Ikaros蛋白質(zhì)異形體在表達(dá)模式上可能存在一定差異, Molnár等[30]發(fā)現(xiàn)小鼠的Ik1和Ik2在淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程中表達(dá)量最高,Ik4僅在淋巴樣祖細(xì)胞中表達(dá), 而其他的蛋白質(zhì)異形體在淋巴細(xì)胞分化的不同階段的表達(dá)量均不高。但是Willett等[19]在斑馬魚中卻發(fā)現(xiàn)4種主要的Ikaros蛋白質(zhì)異形體在各組織中的相對(duì)表達(dá)量相似,Hansen等[16]在虹鱒中也發(fā)現(xiàn)了4種Ikaros蛋白質(zhì)異形體, 而且它們?cè)谛叵?、前腎和脾臟組織中均有相似的表達(dá)。關(guān)于魚類的不同Ikaros蛋白質(zhì)異形體在表達(dá)模式上是否表現(xiàn)為一致目前尚無足夠證據(jù)證明, 應(yīng)在多種魚類中對(duì)該研究?jī)?nèi)容進(jìn)行深入研究。因此作者欲揭示尼羅羅非魚各種Ikaros蛋白質(zhì)異形體的功能以及表達(dá)模式, 可從原位雜交、免疫組化和細(xì)胞培養(yǎng)等研究中入手, 這也將是下一步Ikaros研究中的重點(diǎn)內(nèi)容。

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