草魚(yú)腸道黏膜厭氧細(xì)菌的分離與鑒定

豐文雯 吳山功 郝耀彤 李文祥 李 明 鄒 紅 王桂堂

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072;2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

在魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中, 腸道內(nèi)逐漸形成由好氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌和專性厭氧細(xì)菌組成的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定正常菌群[1,2]。研究證明腸道菌群在魚(yú)類食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、疾病發(fā)生及防治上有重要作用[3]。因此, 近年來(lái)腸道微生物受到了越來(lái)越多的關(guān)注?；诜肿由飳W(xué)技術(shù)的方法, 例如DNA芯片技術(shù)[4]、熒光原位雜交技術(shù)[5]、宏基因組學(xué)技術(shù)[6]等, 能全面分析腸道微生物的種類、豐度信息。但多數(shù)腸道微生物是不可培養(yǎng)的, 尤其是腸道為厭氧和微厭氧的環(huán)境, 厭氧細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境等要求苛刻, 更難以培養(yǎng), 而獲得純培養(yǎng)的細(xì)菌是進(jìn)行微生物功能研究的關(guān)鍵一步。目前, 我們對(duì)魚(yú)類消化道微生物的認(rèn)識(shí)是不充分的。

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的一個(gè)品種, 2015年, 我國(guó)草魚(yú)產(chǎn)量達(dá)到5.68×109kg, 占淡水水產(chǎn)品養(yǎng)殖總量的18.54%[7]。目前, 草魚(yú)腸道微生物受到了廣泛關(guān)注, 吳山功等[8]利用DGGE和T-RFLP技術(shù)研究了草魚(yú)腸道內(nèi)容物微生物種類及其與環(huán)境的關(guān)系, Tran等[9]利用高通量測(cè)序方法研究了草魚(yú)腸道黏膜上的微生物類群,此外, 16S rRNA克隆文庫(kù)也被用于草魚(yú)腸道內(nèi)容物微生物結(jié)構(gòu)的研究[10]。這些研究都是基于分子生物學(xué)方法, 而草魚(yú)消化道微生物的分離培養(yǎng)也有不少文獻(xiàn)報(bào)道, 例如王微微等[11]采用羧甲基纖維素瓊脂培養(yǎng)基篩選草魚(yú)腸道中的纖維素降解細(xì)菌, Sugita等[12]采用7種不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)草魚(yú)腸道微生物,探究其與宿主草魚(yú)之間的關(guān)系。以上結(jié)果都是在有氧條件下獲得的, Trust等[13]1979年首次分離出草魚(yú)腸道專性厭氧微生物, 主要為擬桿菌屬(Bacteroides)、放線菌屬(Actinomyces)、梭菌屬(Clostridium)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus), 但他們的工作沒(méi)有區(qū)分腸道黏膜和腸道內(nèi)容物中的細(xì)菌。腸道黏膜上的微生物被認(rèn)為是固有微生物[14], 固有微生物在維持個(gè)體正常生理活動(dòng)中起重要作用[3]。

本研究以饑餓2個(gè)月的草魚(yú)腸道黏膜為材料,采用傳統(tǒng)厭氧微生物培養(yǎng)方法對(duì)草魚(yú)腸道黏膜固有微生物進(jìn)行了分離鑒定, 以期建立魚(yú)類腸道厭氧微生物的培養(yǎng)方法, 為豐富草魚(yú)消化道可培養(yǎng)微生物種類及其功能研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

BHIA腦心浸液培養(yǎng)基(青島海博生物)的配制方法: 稱取18.5 g腦心浸液培養(yǎng)基溶于500 mL去離子水, 加入0.1%刃天青(上海源葉生物)0.4 mL, 加熱煮沸10min, 再加入5 g瓊脂。待瓊脂完全溶化后,加入0.25 g L-半胱氨酸(中國(guó)上海國(guó)藥), 繼續(xù)煮沸至紅色消失, 轉(zhuǎn)移至厭氧瓶(北京豐美)中, 121℃滅菌20min。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)草魚(yú)來(lái)源于黃岡水產(chǎn)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)基地, 體質(zhì)量536.9 g, 體長(zhǎng)37.90 cm。草魚(yú)帶回后于實(shí)驗(yàn)魚(yú)房中飼養(yǎng)2個(gè)月, 期間不投喂飼料且每星期換水一次, 直至草魚(yú)腸道排空, 菌群趨于穩(wěn)定。

1.3 樣品采集

將實(shí)驗(yàn)用魚(yú)置于解剖盤(pán)中, 75%酒精擦拭體表3次, 用解剖剪沿肛門(mén)向上朝前呈弧形剪開(kāi), 在未取出腸道前按結(jié)構(gòu)把草魚(yú)腸道分為前腸、中腸和后腸, 并用細(xì)線進(jìn)行結(jié)扎[15], 取出腸道, 剝離腸道外壁脂肪, 迅速轉(zhuǎn)移至厭氧手套箱(Coy)中。待厭氧手套箱中H2和O2含量穩(wěn)定后開(kāi)始采集各腸段黏膜。用無(wú)菌解剖剪沿各部分腸道縱向剪開(kāi), 用PBS緩沖液(pH=7.2)漂洗3次, 最后用無(wú)菌解剖刀輕輕刮取0.5 g黏膜到10 mL離心管中[14]。

1.4 厭氧條件下細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

向上述裝有黏膜樣品的離心管中加入4.5 mL PBS緩沖液, 充分混勻。吸取0.5 mL勻漿液到另一盛有4.5 mL PBS緩沖液的離心管中進(jìn)行稀釋, 作為10-2倍黏膜稀釋液。按上述步驟, 制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8倍不同稀釋度的腸道黏膜稀釋液。取前腸稀釋度為10-2、10-3和10-4, 中腸稀釋度為10-3、10-4和10-5, 后腸稀釋度為10-6、10-7和10-8的黏膜勻漿液涂布到BHIA培養(yǎng)基上, 每個(gè)稀釋度重復(fù)3次, 涂布均勻后在28℃下厭氧培養(yǎng)48h[16]。最后從前腸、中腸和后腸培養(yǎng)基上各挑取約100個(gè)單菌落接種在液體BHIA培養(yǎng)基中, 28℃震蕩培養(yǎng)48—72h。

1.5 可培養(yǎng)細(xì)菌DNA的提取和16S rRNA擴(kuò)增

在無(wú)菌操作臺(tái)中用2 mL注射器分別從300個(gè)厭氧瓶中吸取培養(yǎng)液1—2 mL離心管中, 每個(gè)離心管中裝有2種規(guī)格的小磁珠(0.3 g 0.1 mm和0.1 g 0.5 mm),渦旋3min[17]。隨后以菌液為模板, 用細(xì)菌通用引物27F、1492R和Go Taq Green Master Mix酶進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(終體積25 μL):80 ng DNA, 10 μmol/L引物, 9.5 μL無(wú)核苷酸水,12.5 μL Go Taq Green Master Mix酶。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 53℃退火30s,72℃延伸1min30s, 運(yùn)行30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上140V電泳30min后, 于凝膠成像系統(tǒng)中觀察, 并用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(北京艾德萊)對(duì)1500 bp的條帶進(jìn)行回收, 回收產(chǎn)物用pMD18-T載體(TaKaRa, 中國(guó)大連)連接轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 涂布于57 mg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上, 37℃培養(yǎng)10h。隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子, 用載體通用引物M13(+)和M13(-)檢測(cè)質(zhì)粒是否插入成功, 對(duì)檢測(cè)結(jié)果條帶大小為1700 bp的單克隆送測(cè)序。

1.6 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

采用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接并去除載體序列[18], 然后將序列導(dǎo)入Ezbiocloud (www.ezbiocloud.net)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)。同時(shí)序列文件輸入Ribosomal Database Project (RDP) Release11數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析[19]。通過(guò)Aligner序列比對(duì), Complete Linkage Clustering聚類分析, 最后在Representative Sequence中選出每個(gè)聚類文件中的代表序列。用MEGA7.0[20]根據(jù)Kimura-two-parametermodel遺傳距離模型[21], 采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)[22]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。上述序列已上傳至GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中, 序列登錄號(hào)為MG428715-MG428988。

2 結(jié)果

2.1 草魚(yú)腸道厭氧條件下可培養(yǎng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)

不同腸段, 厭氧條件下可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量不同。前腸可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量是3.17×103cfu/g, 中腸可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量為1.63×104cfu/g, 后腸可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量明顯增多, 達(dá)到1.79×107cfu/g(表 1)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 前腸與中腸可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有顯著差異(P＞0.05), 但前腸和中腸可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量都與后腸可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異極顯著(P＜0.01)。

2.2 草魚(yú)腸道厭氧條件下可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定

本實(shí)驗(yàn)從前中后腸共挑取300個(gè)單菌落, 最終成功鑒定出274株細(xì)菌, 其中前腸97株, 中腸92株,后腸85株。經(jīng)Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 共鑒定出15種細(xì)菌, 其中專性厭氧細(xì)菌4種, 占9.1%, 兼性厭氧細(xì)菌11種, 占90.9%(表 2、表 3)。比對(duì)分析結(jié)果表明, 草魚(yú)腸道黏膜中優(yōu)勢(shì)菌株為氣單胞菌屬, 占79.9%, 其次擬桿菌屬占7.7%, 希瓦氏菌屬占5.5%,芽孢桿菌屬占2.9%。

前腸微生物有7種(表 3), 分別為Aeromonas hydrophila、A.aquatica、A. encheleia、A. piscicola、Bacillus licheniformis、Citrobacter youngae、Shewanella xiamenensis; 中腸微生物類群主要有8種(表 2、表 3), 分別為Bacteroides luti、B. spaurosaccharolyticus、A. hydrophila、A. aquatica、A.encheleia、B. licheniformis、Pantoea ananatis、S.xiamenensis; 后腸微生物類群主要有12種(表 2、表3), 分別為B. luti、B. spaurosaccharolyticus、Cetobacterium somerae、Fusobacterium ulcerans、A.hydrophila、A. allosaccharophila、A. encheleia、B.licheniformis、P. ananatis、S. oneidensis、S. xiamenensis、F. acidificum。由此可知, 前腸中未分離到專性厭氧菌, 豐度最高的細(xì)菌是嗜水氣單胞菌(78/274), 而A. piscicola(1/274)和C. youngae(2/274)僅僅在前腸出現(xiàn)。C. somerae(3/274)和F.ulcerans(1/274)是專性厭氧細(xì)菌, 只在后腸出現(xiàn)。

表 1 不同腸段厭氧細(xì)菌數(shù)量Tab. 1 Numbers of anaerobic bacteria in different intestinal segment (cfu/g)

表 2 草魚(yú)腸道可培養(yǎng)專性厭氧細(xì)菌數(shù)目、種類及分布Tab. 2 Numbers, species and distribution of cultivable obligate anaerobes in intestine of grass carp

表 3 草魚(yú)腸道可培養(yǎng)兼性厭氧細(xì)菌數(shù)目、種類及分布Tab. 3 Numbers, species and distribution of cultivable facultative anaerobes in intestine of grass carp

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取15種細(xì)菌的代表性序列及其參考菌株序列, 另外以2個(gè)古細(xì)菌Methanobrevibacter smithii和Methanothermobacter marburgensis作為外類群序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。在草魚(yú)腸道黏膜中, 細(xì)菌的主要類型有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。

3 討論

3.1 厭氧情況下草魚(yú)腸道黏膜可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量情況

草魚(yú)腸道有8個(gè)彎曲, 其長(zhǎng)度是體長(zhǎng)的兩倍, 按結(jié)構(gòu)可分為前、中、后腸3段[23]。本實(shí)驗(yàn)用厭氧方法培養(yǎng)了草魚(yú)腸道不同腸段黏膜上細(xì)菌的種類和數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示草魚(yú)前中后腸腸段黏膜上可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量分別是3.17×103、1.63×104、1.79×107cfu/g。該結(jié)果與Trust等[13]的研究有很大的差異, 他們?cè)趨捬鯒l件下培養(yǎng)的草魚(yú)腸道內(nèi)容物和黏膜前中后腸細(xì)菌總數(shù)平均值分別為9.0×106、4.3×107、7.7×108cfu/g。這種差異說(shuō)明草魚(yú)腸道內(nèi)容物中也存在大量厭氧微生物, 同時(shí), 所使用的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件差異也可能造成數(shù)量差異。本研究使用了BHIA培養(yǎng)基, 而Trust等[13]運(yùn)用了多種不同培養(yǎng)基。同時(shí), 在Trust的研究中, 細(xì)菌培養(yǎng)溫度為37℃, 而本次實(shí)驗(yàn)中為28℃。不同細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度不同, 超過(guò)其最適生長(zhǎng)溫度將導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)[24]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 在厭氧條件下,前腸微生物比中腸微生物少, 前腸和中腸微生物顯著比后腸少, 前腸分離到的都是兼性厭氧微生物,專性厭氧細(xì)菌只在中后腸有發(fā)現(xiàn), 后腸居多。研究表明, 魚(yú)類或白蟻后腸為低氧或厭氧環(huán)境[25,26], 因此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由于宿主消化道氧的分布不同造成的。

在魚(yú)類腸道中, 好氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌和專性厭氧細(xì)菌同時(shí)存在, 多數(shù)研究結(jié)果顯示, 專性厭氧細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)兼性厭氧細(xì)菌[27], 但是本實(shí)驗(yàn)通過(guò)厭氧培養(yǎng)的方法結(jié)果得到的專性厭氧細(xì)菌和兼性厭氧細(xì)菌的比例約為1鯰10。對(duì)于在厭氧條件下, 得到兼性厭氧細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)多于專性厭氧細(xì)菌的現(xiàn)象, 推測(cè)可能是以下兩個(gè)方面的原因: 第一,某些專性厭氧細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求苛刻[2], 在本次實(shí)驗(yàn)中, 并沒(méi)有對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化, 因此單一的生長(zhǎng)環(huán)境可能不能滿足某些專性厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)需求; 第二, 某些專性厭氧菌株生長(zhǎng)較慢,在一些研究中, 專性厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間為7d[28],而本實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為2d, 因此有些生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌可能未被培養(yǎng)出來(lái), 導(dǎo)致得到的專性厭氧細(xì)菌數(shù)量比較少。

圖1 基于草魚(yú)腸道黏膜厭氧細(xì)菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of intestinal mucosa anaerobes of grass carp

3.2 厭氧情況下草魚(yú)腸道黏膜可培養(yǎng)細(xì)菌種類情況

魚(yú)類腸道微生物的組成取決于營(yíng)養(yǎng)狀況。肉食性魚(yú)類如青魚(yú)腸道中的優(yōu)勢(shì)群落為蛋白酶產(chǎn)生菌, 這些細(xì)菌能將食物中復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解為各種氨基酸以利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收, 而草食性魚(yú)類如草魚(yú)腸道中則多為纖維素酶或淀粉酶產(chǎn)生菌[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 草魚(yú)腸道黏膜中存在大量的兼性厭氧細(xì)菌如氣單胞菌屬的種類。這與蔣燕等的結(jié)果是一致的, 他們發(fā)現(xiàn)饑餓狀態(tài)下, 氣單胞菌屬的種類是草魚(yú)腸道黏膜上的優(yōu)勢(shì)菌種, 能夠分泌纖維素酶[30]。氣單胞菌是常見(jiàn)的條件致病菌[31], 但是它在有機(jī)物發(fā)酵[32]、纖維素降解[30]和免疫調(diào)節(jié)[33]方面有重要作用, 因此氣單胞菌可能在草魚(yú)的消化道生理中發(fā)揮重要作用[8], 應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行重新認(rèn)識(shí)。本研究共發(fā)現(xiàn)3個(gè)屬的專性厭氧微生物, Trust等[13]研究, 草魚(yú)腸道中主要存在5種專性厭氧微生物, 分別為擬桿菌屬、放線菌屬、梭菌屬、梭形桿菌屬和消化鏈球菌屬, 這可能與所用培養(yǎng)基不一致引起的,本研究使用BHIA培養(yǎng)基, 而Trust在此基礎(chǔ)上, 還試用了TSA、RCM、PYGA、EYA、PYSC、BBA培養(yǎng)基, 其中, RCM為強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基, 有利于梭菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)。本研究中的擬桿菌屬細(xì)菌經(jīng)Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與B. luti和B. paurosaccharolyticus的匹配值分別為89%和92%。在微生物分類中認(rèn)為, 16S rRNA相似度小于95%時(shí)可能為不同屬[34], 因此, 以上2株細(xì)菌是否屬于擬桿菌屬類細(xì)菌有待于進(jìn)一步進(jìn)行生理生化、進(jìn)化地位及分子生物學(xué)的研究。此外, 本研究還在草魚(yú)的后腸中發(fā)現(xiàn)了C. somerae, 鯨桿菌是淡水魚(yú)類腸道生產(chǎn)維生素B12的主要細(xì)菌之一[28], 存在于草魚(yú)后腸黏膜中,說(shuō)明其是固有微生物之一, 能夠長(zhǎng)期定植于腸道表面, 持續(xù)提供維生素B12供機(jī)體利用。益生菌是一類提高宿主健康水平的有益微生物, 它們?cè)鰪?qiáng)宿主抵抗有害微生物的能力, 提高食物轉(zhuǎn)化率, 產(chǎn)生有機(jī)酸, 水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常被作為飼料添加劑[35]。目前應(yīng)用較多的為芽孢桿菌屬細(xì)菌, 例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌等[36]。研究表明, 地衣芽孢桿菌能夠增強(qiáng)鳊魚(yú)機(jī)體免疫力和抗氧化能力[37], 同時(shí)分泌各種消化酶, 提高各種營(yíng)養(yǎng)成分的利用率, 從而降低水產(chǎn)養(yǎng)殖成本, 提高經(jīng)濟(jì)效益[38]。

4 總結(jié)

本研究通過(guò)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法, 成功分離出草魚(yú)腸道黏膜專性厭氧細(xì)菌, 但是由于實(shí)驗(yàn)中僅運(yùn)用了一種培養(yǎng)基, 而腸道的營(yíng)養(yǎng)條件比較復(fù)雜, 不同厭氧微生物的營(yíng)養(yǎng)需求不同, 因此本研究對(duì)厭氧微生物的認(rèn)識(shí)還很膚淺, 沒(méi)有能夠全面揭示草魚(yú)腸道黏膜厭氧微生物的組成和結(jié)構(gòu), 還需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以充分認(rèn)識(shí)消化道厭氧微生物。

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