丁酸鈉減輕小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)肝臟損傷的研究

羅千江 李林 魏振宇 劉慧玲 江潔 尉秀清

敗血癥是臨床上較為常見的危重疾病，病死率可高達(dá)50%以上，其原因主要是與先天免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等相關(guān)[1-2]。其中內(nèi)毒素血癥是由于血中細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后釋放出大量內(nèi)毒素至血液，或輸入大量內(nèi)毒素污染的液體而引起的一種病理生理表現(xiàn)。內(nèi)毒素本質(zhì)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖，是誘發(fā)機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要致病因子。肝臟既是清除內(nèi)毒素的場所，也是內(nèi)毒素血癥易受損的靶器官之一。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷是多種肝病的主要病理生理基礎(chǔ)[3-4]。目前很多研究發(fā)現(xiàn)，肝臟枯否細(xì)胞內(nèi)激活多種信號通路，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷的關(guān)鍵機(jī)制[5]。

短鏈脂肪酸(SCFA)是指由腸道菌群通過發(fā)酵食物中未被小腸吸收消化的膳食纖維而產(chǎn)生的碳鏈為1-6的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等[6]。大量研究表明，通過調(diào)節(jié)炎癥因子的生成，SCFA可以干預(yù)炎癥反應(yīng)，它們還可以參與改變嗜中性粒細(xì)胞的功能和遷移，抑制TNF-α和1L-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附分子表達(dá)[7]。此外，SCFA還能通過阻斷INF-γ通路調(diào)節(jié)炎癥性腸病的炎癥反應(yīng)[8]。因此SCFA在炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，研究其是否能夠抑制肝臟枯否細(xì)胞過量產(chǎn)生致炎因子從而緩解內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷具有重要意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體(SPF)C57/bl6小鼠40只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物合格證號：44007200037958)，嚴(yán)格按照SPF級要求，飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院疫苗研究所動物中心，所有的程序均按照實(shí)驗(yàn)室動物的護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

二、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.主要實(shí)驗(yàn)試劑及抗體

丁酸鈉(Sigma，美國)，脂多糖(Sigma，美國)，ALT試劑盒(Cusabio，武漢)，AST試劑盒(Cusabio，武漢) ，Trizol試劑盒(Magen，北京)，qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，上海)，蘇木素-伊紅染料(中杉金橋,北京)，EDTA抗原修復(fù)液(pH6.0)(中杉金橋，北京)，TUNEL試劑盒(Roche，瑞士)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(DAKO，Denmark/上?；蚩萍脊?等。

2.主要儀器

低溫高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)， PCR 儀(Labnet，美國)，Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)，Real-time PCR專用儀CXFconnet(Bio-RAD公司，美國)，酶標(biāo)儀(BIO-TEK，EXL-800，美國)，熒光倒置顯微鏡(Leica，德國)，正置顯微鏡(Leica，德國)，免疫組織化學(xué)(組化)筆(上?；蚩萍脊?等。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷模型

40只雌性小鼠隨機(jī)分成丁酸鈉+內(nèi)毒素組、內(nèi)毒素組、丁酸鈉組、正常對照組，每組10只。丁酸鈉+內(nèi)毒素組：預(yù)處理予腹腔注射丁酸鈉500 mg/kg，30 min后腹腔注射內(nèi)毒素5 mg/kg[1]。內(nèi)毒素組：預(yù)處理予腹腔注射相對應(yīng)量的生理鹽水，30 min后腹腔注射內(nèi)毒素5 mg/kg。丁酸鈉組：預(yù)處理予腹腔注射丁酸鈉500 mg/kg，30 min后相對應(yīng)量的生理鹽水。正常對照組：2個時間點(diǎn)分別腹腔注射等量的生理鹽水。

2.標(biāo)本采集與處理

腹腔注射脂多糖6 h后，10%水合氯醛麻醉，眼球內(nèi)眥靜脈叢采血，再行開腹手術(shù)，迅速分離取下肝臟組織，將部分肝臟組織保存于液氮中，待提取蛋白質(zhì)或RNA，剩余部分放入10%甲醛固定液中固定制作石蠟標(biāo)本；血漿在室溫靜置1 h后以1 000轉(zhuǎn)/分離心3 min，取上層血清保存于-80℃冰箱。

3.ELISA檢測ALT、AST水平

根據(jù)各ELISA試劑盒說明書，分別檢測4組血清中ALT、AST水平。

4.肝臟組織RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

各組取適量肝臟組織，按照Trizol試劑說明書進(jìn)行提取肝臟組織RNA，并用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測定提取的RNA濃度及純度；按照TOYOBO 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；應(yīng)用SYBR Green法對目的基因TNF-α、IL-1β、IL-6及內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。

5.蘇木素-伊紅染色

石蠟切片，經(jīng)過脫蠟和階梯水化后，蘇木素液染核1～3 min，后于流動的蒸餾水中洗去蘇木素液，PBST返藍(lán)，伊紅染色5～60 s，自來水漂洗，顯微鏡下觀察染色效果后用中性樹膠封片。

6.免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)過脫蠟和階梯水化后，置于3%H2O2中室溫10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶；將切片放入pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液中進(jìn)行高溫高壓熱修復(fù)抗原3 min；待溫度冷卻至室溫后取出切片，免疫組化筆畫圈；用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，室溫孵育10 min；滴加15～20 μl一抗(1∶200)，4℃孵育過夜; PBST泡洗5 min，滴加15～20 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶400)，37℃孵育2 h；DAB顯色5 s～10 min，自來水漂洗5 min；蘇木素復(fù)染；顯微鏡下觀察染色效果，防止過染，中性樹膠封片。正置顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照及結(jié)果分析：雙盲法隨機(jī)選取20個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

7.TUNEL 檢測及凋亡指數(shù)

參照Roche公司的TUNEL試劑產(chǎn)品說明書進(jìn)行凋亡指數(shù)檢測，DAB顯色后細(xì)胞核呈棕褐色為陽性。每張切片隨機(jī)選取20個視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)和肝細(xì)胞總數(shù)，凋亡指數(shù)= 陽性細(xì)胞數(shù)/上皮細(xì)胞總數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各處理組別小鼠血清中ALT、AST的含量

與正常對照組的ALT、AST水平比較，丁酸鈉組無明顯差異(P>0.05)；內(nèi)毒素組和丁酸鈉+內(nèi)毒素組均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.001)；而丁酸鈉+內(nèi)毒素組較內(nèi)毒素組的ALT、AST水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.001)，見表1。

表1 各處理組小鼠血清中AST、ALT的含量分析

注：與正常對照組比較，AST丁酸鈉組=0.13,P=0.90；ALT丁酸鈉組=0.43,P=0.68；AST內(nèi)毒素組=16.88,aP﹤0.01；ALT內(nèi)毒素組=22.53,aP﹤0.01；AST丁酸鈉+內(nèi)毒素組=7.93,aP﹤0.01；ALT丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.25,aP﹤0.01；與丁酸鈉組比較，AST內(nèi)毒素組=17.01,bP﹤0.01；ALT內(nèi)毒素組=22.96,bP﹤0.01；AST丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.06,bP﹤0.01；ALT丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.68,bP﹤0.01；與內(nèi)毒素組比較， AST丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.95,cP﹤0.01；ALT丁酸鈉+內(nèi)毒素組=14.27,cP﹤0.01

二、不同處理組小鼠肝臟炎癥因子mRNA的表達(dá)情況

與正常對照組相比，丁酸鈉組肝臟炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平無明顯差異(P>0.05)；內(nèi)毒素組上述指標(biāo)的mRNA水平則升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.01)；丁酸鈉+內(nèi)毒素組TNF-α、IL-6 mRNA水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.01)，而IL-1β mRNA水平無明顯差異(P>0.05)；丁酸鈉+內(nèi)毒素組較內(nèi)毒素組上述指標(biāo)的mRNA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹤0.01)，見表2。

三、各處理組小鼠肝臟蘇木素-伊紅染色對肝臟損傷的評估

丁酸鈉組與正常對照組小鼠的肝臟組織無明顯異常(圖1A、B)；內(nèi)毒素組表現(xiàn)為明顯肝內(nèi)淤血，肝細(xì)胞腫脹致正常肝竇間隙消失，失去正常的肝索結(jié)構(gòu)，絕大部分肝細(xì)胞胞漿疏松化，炎癥細(xì)胞浸潤增加(圖1C)；丁酸鈉+內(nèi)毒素組的病理顯示肝內(nèi)淤血，部分肝細(xì)胞胞漿疏松化，炎癥細(xì)胞浸潤增加(圖1D)。

表2 不同處理組別小鼠肝臟炎癥因子的相對mRNA表達(dá)情況分析

注：與正常對照組比較，TNF-α丁酸鈉組=0.02,P=0.98；IL-1β丁酸鈉組=0.93,P=0.38；IL-6丁酸鈉組=0.02,P=0.98；TNF-α內(nèi)毒素組=11.60,aP﹤0.01；IL-1β內(nèi)毒素組=17.03,aP﹤0.01；IL-6丁酸鈉組=13.28,aP﹤0.01；TNF-α丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.89,aP﹤0.01；IL-1β丁酸鈉+內(nèi)毒素組=2.09,P=0.07；IL-6丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.12,bP﹤0.05;與丁酸鈉組比較，TNF-α內(nèi)毒素組=11.58,cP﹤0.01；IL-1β內(nèi)毒素組=17.94,cP﹤0.01；IL-6內(nèi)毒素組=13.30,cP﹤0.01；TNF-α丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.87,cP﹤0.01；IL-1β丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.02,dP﹤0.05；IL-6丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.14,cP﹤0.01；與內(nèi)毒素組比較， TNF-α丁酸鈉+內(nèi)毒素組=7.70,eP﹤0.01；IL-1β丁酸鈉+內(nèi)毒素組=14.92,eP﹤0.01;IL-6丁酸鈉+內(nèi)毒素組=10.15,eP﹤0.01

圖1 各處理組小鼠肝臟蘇木素-伊紅染色(×200)

A：正常對照組；B：丁酸鈉組；C：內(nèi)毒素組；D：丁酸鈉+內(nèi)毒素組

四、各處理組小鼠肝臟免疫組化MPO染色檢測炎癥因子浸潤的情況

丁酸鈉組與正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)鮮見MPO陽性信號(圖2A、B)，而內(nèi)毒素組肝臟組織內(nèi)MPO陽性信號增多(圖2C)。丁酸鈉+內(nèi)毒素組可見散在MPO信號(圖2D)，每個組織樣品免疫組化染色隨機(jī)計(jì)數(shù)900個細(xì)胞，記錄陽性信號細(xì)胞數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素組MPO陽性細(xì)胞數(shù)是丁酸鈉+內(nèi)毒素組陽性細(xì)胞數(shù)的2.39±0.30倍，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LSD-t=13.56,P<0.01)。

圖2 各處理組小鼠肝臟免疫組化MPO染色檢測炎癥因子浸潤的情況(MPO免疫組化染色，×200)

A：正常對照組；B：丁酸鈉組；C：內(nèi)毒素組；D：丁酸鈉+內(nèi)毒素組

五、TUNEL染色檢測肝臟細(xì)胞凋亡情況

丁酸鈉組與正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)未見TUNEL陽性信號(圖3A、B)，丁酸鈉+內(nèi)毒素組可見個別TUNEL信號(圖3D)，而內(nèi)毒素組肝臟組織內(nèi)可見些許TUNEL凋亡信號(圖3C)。每個組織樣品染色隨機(jī)計(jì)數(shù)900個細(xì)胞，記錄陽性信號細(xì)胞數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素組TUNEL陽性信號是丁酸鈉+內(nèi)毒素組陽性信號數(shù)的4.89±2.17倍，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LSD-t=6.01,P<0.01)。

圖3 各處理組小鼠肝臟TUNEL染色檢測肝臟細(xì)胞凋亡情況(×200)

A：正常對照組；B：丁酸鈉組；C：內(nèi)毒素組；D：丁酸鈉+內(nèi)毒素組；紅色指示陽性信號

討 論

SCFA能夠?yàn)槟c黏膜細(xì)胞提供能量，還能調(diào)節(jié)人體腸道菌群，有很多研究表明它可以預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生，具有抗腫瘤的作用，此外還有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用[10-11]。Cabezas等[12]就有利用膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生SCFA來抑制大腸炎癥反應(yīng)的研究。而我們的結(jié)果證明了腹腔注射丁酸鈉可以緩解內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肝臟炎癥反應(yīng)，與絕大多數(shù)研究結(jié)果一致。GPR41、GPR43是SCFA的受體，它們位于同一條染色體上，是G蛋白偶合家族的組成成分，具有30%～40%的同源性，但是組織分布不一樣，GPR43主要高表達(dá)于造血組織，單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞。Vinolo等[13]采用了SCFA中的乙酸鹽可以減輕機(jī)體免疫反應(yīng)，證明乙酸通過激活免疫細(xì)胞GPR43來減輕炎癥。本研究證實(shí)了丁酸鈉可以緩解內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肝臟炎癥反應(yīng)，其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步深入探究。

丁酸是可吸收酸，在正常機(jī)體內(nèi)，由腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸很少，血液循環(huán)中的丁酸是較微量的，因此刺激免疫細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用能力較弱。雖然我們的研究是予以腹腔注射500 mg/kg這一較大劑量的丁酸鈉，卻未出現(xiàn)明顯酸中毒等過量表現(xiàn)，而且可以緩解內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肝損傷。在腸道低劑量的丁酸是受體依賴性的吸收，大劑量時是濃度梯度依賴的自由穿梭吸收[14-15]。因此我們猜測通過外源性給予胃腸道補(bǔ)充丁酸，比如服用丁酸鈉或產(chǎn)丁酸的益生菌如丁酸梭菌，可能可以通過提高血液里的丁酸濃度達(dá)到預(yù)防和緩解急性炎癥反應(yīng)的目的，這方面的研究急需開展。

肝硬化、肝功能衰竭等常常出現(xiàn)肝昏迷，而丁酸是酸性物質(zhì)，腸道補(bǔ)充丁酸或產(chǎn)丁酸的益生菌是否可以用于預(yù)防肝昏迷值得探討和研究。另外肝硬化、肝衰竭等患者常常發(fā)生內(nèi)源性內(nèi)毒素血癥，而且對內(nèi)毒素滅活能力降低，會進(jìn)一步加重肝損傷，因此腸道補(bǔ)充丁酸或產(chǎn)丁酸的益生菌是否對此類患者肝功能起到一定的保護(hù)作用的研究也非常值得開展。

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