慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡、心肌纖維化及其相關(guān)性研究

魏 玲，李慧萍，魏 偉，劉 茜，尹 娜，甘世保，楊 靜，李麗娟，潘興華

心肌重構(gòu)是目前公認的慢性心衰的病理生理機制，心肌細胞凋亡及心肌纖維化是其重要的病理基礎(chǔ)。本研究探討了慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡及心肌纖維化的變化及其兩者的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型建立 SPF級健康雄性SD大鼠 20 只，約 3 月齡，體重（300±30）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[許可證號：SCXK（滇）2011-0005]，經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分成心衰組及正常組。心衰組連續(xù)腹腔注射異丙腎上腺素，3 mg/(kg·d)，共14 d，以建立大鼠慢性心衰模型；正常組則同步腹腔注射等體積生理鹽水。末次注射后2 w，進行超聲心動圖檢測，以射血分數(shù)≦50%為造模成功[1]。

1.2 心肌組織標(biāo)本的制備 實驗結(jié)束前一夜，全部大鼠禁食、水，實驗結(jié)束當(dāng)天稱取大鼠體重后，麻醉大鼠，剪開胸腔，取出心臟，用冰生理鹽水洗滌血污，剔除脂肪、血管等非心肌組織后，無菌紗布吸干心臟表面，取左心室部分心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作心肌標(biāo)本石蠟切片。

1.3 HE染色 心肌標(biāo)本采用常規(guī)HE染色法，切片經(jīng)蘇木素染色后，用伊紅液復(fù)染，在光學(xué)照相顯微鏡下觀察并采圖。

1.4 Masson染色 心肌標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，Weigert鐵蘇木素染色5 min，自來水洗，用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗數(shù)分鐘，麗春紅酸性品紅液染色5 min，蒸餾水快速沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理5 min，不水洗用苯胺藍染液復(fù)染5 min，1%冰醋酸浸泡1 min，95%酒精多次脫水，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.5 TUNEL染色 心肌標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，用蛋白酶K工作液覆蓋組織，37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，5 min/次。制備TUNEL染色混合液，取Tunel試劑盒內(nèi)適量 TdT和 dUTP按 2∶29混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，37℃孵育2 h，PBS沖洗3次，5 min/次。切片稍甩干后，每張切片加50 μl converter-POD覆蓋組織，37℃孵育30 min。PBS洗滌3次，5 min/次，切片上滴加適量DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，蘇木素復(fù)染3 min左右，自來水洗，將切片依次放入75%乙醇6 min、85%乙醇6 min、無水乙醇Ⅰ6 min、無水乙醇Ⅱ6 min、二甲苯Ⅰ5 min脫水透明，中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗，兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立 根據(jù)心臟彩超結(jié)果及判定標(biāo)準（LVEF≤50%），心衰組制備心衰模型均成功。造模后2 w，正常組射血分數(shù)為(73.56±5.12)%，顯著高于心衰組的(41.32±6.86)%（P＜ 0.01）。

2.2 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)HE染色比較 HE染色結(jié)果顯示，心衰組心肌細胞肥大、壞死、心肌纖維化伴炎性細胞浸潤，心肌細胞間隙增大伴水腫。而正常組心肌組織心肌纖維排列整齊，細胞形態(tài)正常，未見上述病理改變（圖1）。

2.3 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)Masson染色比較 正常組心肌組織纖維排列整齊，僅見少量的膠原纖維增生。心衰組心肌纖維化明顯，大量心肌細胞壞死被膠原纖維替代，殘留的心肌細胞排列紊亂。心衰組膠原容積比（CVF%）為（55.23±3.55）%，較正常組的（0.32±0.09）%顯著增加（P＜ 0.01）。

2.4 兩組心肌細胞凋亡比較 正常組心肌細胞凋亡數(shù)量很少，而心衰組心肌細胞凋亡率為(44.36±4.17)%，較正常組的 (1.25±0.66)%顯著增加（P＜0.01，圖 3）。

2.5 心肌膠原容積比與心肌細胞凋亡率的相關(guān)性分析 心衰組心肌膠原容積比與心肌細胞凋亡率資料均呈正態(tài)分布，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，心肌膠原容積比與心肌細胞凋亡呈顯著正相關(guān)（r=0.893，P＜ 0.01）。

3 討論

心臟重構(gòu)是指心臟受到缺血損傷、神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活、血流動力學(xué)改變等慢性刺激后，以心肌細胞肥大、心肌細胞凋亡及心肌纖維化為特征的病理表現(xiàn)，導(dǎo)致心臟外觀、大小和功能變化，既是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的決定機制，也是心功能障礙的獨立危險因素[1]。心肌細胞死亡包括心肌細胞自噬、壞死及凋亡3種形式，其發(fā)生在各種心血管疾病，如心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注的急性及慢性期，其中心肌細胞凋亡即是心肌細胞死亡的主要形式[2]。成人心肌細胞屬于終末分化細胞，當(dāng)心肌組織遭受缺血、缺氧、氧化應(yīng)激及壓力超負荷時，結(jié)果會誘導(dǎo)心肌細胞受損傷，心肌細胞凋亡，心肌細胞數(shù)量減少和心肌纖維化[3]。

圖1 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)HE染色比較（400×）

圖2 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)Masson染色比較(400×)

圖3 兩組心肌細胞凋亡比較(400×，TUNEL染色)

心肌細胞凋亡是代償性心肌重構(gòu)轉(zhuǎn)向心力衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是心臟功能進行性惡化及最終死亡的重要基礎(chǔ)[4]。紐約心臟病協(xié)會報道，心功能Ⅲ、Ⅳ的心衰患者的心肌凋亡比占心肌組織的0.12%～0.70%，而正常心肌組織只占0.001%～0.01%[5]。Van等[6]研究發(fā)現(xiàn),如果某心肌組織中的心肌細胞凋亡率＞0.1%時，該心肌組織每年會有近37%的心肌細胞死亡。研究報道，自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)生心肌肥厚及心肌細胞凋亡時，其心肌細胞凋亡數(shù)是正常組的4倍[7]。心肌纖維化是心功能障礙、心臟驟停及心律失常的獨立預(yù)測因素，也是心臟重構(gòu)的一大病理特征[8]。根據(jù)有無心肌細胞壞死及心肌瘢痕組織形成，心肌纖維化分為反應(yīng)性纖維化及修復(fù)性纖維化。反應(yīng)性纖維化又分為間質(zhì)纖維化及血管周圍纖維化，其不出現(xiàn)心肌細胞壞死及瘢痕的形成；修復(fù)性纖維化心肌組織將出現(xiàn)心肌細胞壞死及瘢痕組織。心肌纖維化導(dǎo)致心臟僵硬度增加、順應(yīng)性降低，心臟傳導(dǎo)阻滯，心臟收縮及舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[9]。

本實驗結(jié)果顯示，心衰組心肌纖維化較正常組顯著增加，存在心肌細胞廣泛壞死、心肌纖維斷裂溶解、心肌間質(zhì)膠原纖維過度沉積，大片狀瘢痕組織增生，心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，且心肌細胞凋亡率也顯著升高，提示慢性心衰大鼠存在心肌細胞凋亡率與心肌纖維化，且二者之間的變化呈顯著正相關(guān)。

[1] Li X,Han J,Li L,et al.Effect of farnesyltransferase inhibition on cardiac remodeling in spontaneously hypertensive rats[J].International Journal of Cardiology,2013,168(4):3340-3347.

[2] 劉啟壽,劉景群.充血性心力衰竭患者心肌纖維化變化的研究[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2014,21(31):42-45.

[3] Grazia Maria Virzi,Anna Clementi,Claudio Ronco,et al.Celluar apotosis in the Cardiorenal axis[J].Springer Science,2016,21(2):177-189.

[4] 王紅英,曹雪濱.心力衰竭與心肌細胞凋亡的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(18):2727-2730.

[5] Amabel M,Orogo,Asa B,et al.Cell death in the myocardium:my heart won't go on[J].IUBMB Life,2013,65(8):651-656.

[6] Van Empel VP,Bertrand AT,Hofstra L,et al.Myocyte apoptosis in heart failure[J].Cardiovasc Res,2005,67(1):21-29.

[7] Mani K.Programmed cell death in cardiac myocytes:strategies to maximize post-ischemic salvage[J].Heart Fail Rev,2008,13(2):193-209.

[8] Hu SS,Kong LZ,Gao RL,et al.Outline of the report on cardiovascular disease in China[J].Biomed Environ Sci,2012,25(3):251-256.

[9] Davide Lazzeroni,Ornella Rimoldi,Paolo G Camici.From left ventricular hypertrophy to dysfunction and failure[J].Circulation Journal,2016,80(3):555-564.