BMSC移植治療對慢性心衰大鼠心肌結(jié)構(gòu)與功能的影響

王 歡，朱向情，劉 茜，熊云蘭，朱姿英，盧國良，潘興華，魏 玲

有研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）移植可以抑制心肌梗死后心肌纖維化，改善心功能[1-2]。但移植的BMSC是否對慢性心衰心肌纖維具有抑制作用，目前尚無定論。本研究利用慢性心衰大鼠模型，觀察了BMSC對慢性心衰大鼠心肌纖維化、心肌細胞凋亡及心肌膠原Ⅰ和膠原ⅢmRNA表達水平的調(diào)節(jié)作用，探討B(tài)MSC對大鼠慢性心衰進程及心肌重構(gòu)的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DMEM-F12培養(yǎng)基（HyClone公司），胎牛血清（BI公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司），慢病毒載體LV-EGFP（上海吉凱生物有限公司），大鼠成骨誘導完全培養(yǎng)基、SD大鼠成脂誘導完全培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司），鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司)，Masson染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司），TUNEL試劑盒（Roche公司）。

1.2 BMSC的制備 取6只1月齡SD大鼠頸椎脫臼處死，無菌取大鼠股骨、脛骨骨髓，接種于T75細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次全量換液，以后每2～3 d換液1次。當細胞貼壁達80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3進行傳代。按試劑盒操作指南進行BMSC成骨、成脂誘導分化鑒定。取第3代的BMSC重懸后計數(shù)，鋪板于48孔板中，細胞數(shù)為5×105個/孔，以按感染復數(shù)（MOI）150計算并加入慢病毒LV-EGFP，病毒轉(zhuǎn)染滴度為1.8×1010U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)、觀察BMSC生長及GFP表達情況。

1.3 慢性心衰大鼠模型建立及BMSC移植 SPF級雄性 SD 大鼠 30 只，3 月齡，體重（300±30）g，由昆明醫(yī)科大學動物實驗中心提供[許可證號：SCXK（滇）2011-0005]，隨機分為移植組、模型組和正常對照組，每組10只。移植組和模型組大鼠連續(xù)腹腔注射異丙腎上腺素，3 mg/(kg·d)，共 14 d，經(jīng)超聲心動圖測定，左心室射血分數(shù)（LVEF）＜50%。移植組大鼠于尾靜脈注射 EGFP 標記的 BMSC（5×106個/ml，1 ml/只），模型組同步注入同體積生理鹽水，對照不做處理。各組大鼠在造模后2 w及BMSC移植4 w后，用探頭頻率為12 MHz的彩色多普勒超聲心動儀（Philip公司，美國）檢測LVEF。實驗結(jié)束后稱取各組大鼠體重后，麻醉大鼠，取心臟稱重并計算心重/體重指數(shù)。

1.4 各組心肌組織CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA的表達檢測 采用熒光定量PCR法，用RNAiso Plus試劑盒提取總 RNA， 取 2 μg總 RNA，用GoScriptTMReverse Transcription System Kit制備cDNA并置于-20℃冰箱保存。采用熒光定量PCR儀擴增CollagenⅠ和CollagenⅢ，CollagenⅠPCR引物：上游 5'AGAGGCATAAAGGGTCATCGTG3'，下游5'CAGGTTGCAGCCTTGGTTAGG3'。 CollagenⅢPCR引物：上游5'GTCGGAGGAATGGG TGGCT AT3'，下游 5'CATTGCGTCCATCAAA GCCTC3'。內(nèi)參 GAPDH引物：上游 5'TTCCTACCCCCAATG TATCCG3'，下游5'CATGAGGTCCACCACCCTGTT3'。PCR結(jié)束后獲取 Ct值并計算 2-△△Ct，分析表達差異。

1.5 心肌病理組織學觀察 取心臟稱重后的大鼠心肌組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，層厚5 μm，進HE染色、Massons染色及Tunel染色。另取心肌組織，采用OCT法包埋并進行冰凍切片（15 μm），于倒置熒光顯微鏡下觀察植入BMSC的存活及分布情況并采圖。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，重指數(shù)用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用LSD檢驗，兩變量相關性采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC制備及GFP基因標記結(jié)果 大鼠BMSC原代培養(yǎng)48 h后，可見少量細胞貼壁，成短小梭形或三角形（圖1A）。貼壁生長后體積增大，多呈梭形，培養(yǎng)10～14 d左右，融合度達80%～90%（圖1B）。傳代后的BMSC呈均一放射狀排列，成纖維樣細胞外觀（圖1C）。BMSC成骨誘導21 d后，可見明顯的茜素紅染色陽性鈣結(jié)節(jié)（圖1D）。成脂誘導14 d后，細胞內(nèi)可見油紅O染色陽性脂滴（圖1E)。加入LV-EGF培養(yǎng)4 d后，EGFP表達率達90%(圖1F）。

2.2 BMSC在心臟中的定植 注射EGFP標記的BMSC的大鼠的心肌組織經(jīng)冰凍切片后，在熒光顯微鏡下觀察，可見心肌組織出現(xiàn)表達EGFP的綠色熒光細胞（圖2A、2B），模型組及正常對照組則未見綠色熒光細胞（圖 2C、2D）。

2.3 各組心功能、心重/體重指數(shù)及行為學觀察模型組、移植組 HW/BW 分別為（6.01±0.30）%、（5.33±0.23）%，均明顯高于正常組（4.12±0.25）%（P＜ 0.01），但BMSC移植組低于模型組（P＜0.01）。模型組LVEF 為（33.66±2.51）%，低于正常組的（75.67±4.04）%（P＜0.01）。BMSC移植治療4 w后，移植組LVEF為（44.0±3.6）%，高于模型組（P＜ 0.01）。正常組大鼠未見死亡，表現(xiàn)為活潑好動，飲水、攝食正常，體重增加；心衰組大鼠出現(xiàn)體重減輕、攝食飲水減少、呼吸急促、心率增快、精神萎靡等；BMSC移植后，活動能力增強、攝食飲水增加、精神狀態(tài)改善、體重增加、呼吸及心率減慢。

圖1 BMSC生長形態(tài)及EGFP基因標記結(jié)果

2.4 心肌組織病理變化 HE染色顯示，模型組（圖3C）、移植組（圖3B）可見心肌細胞肥大及凋亡、心肌纖維排列紊亂、心肌間質(zhì)炎性細胞浸潤伴纖維瘢痕組織增生，而正常組（圖3C）未見上述病理改變。BMSC治療4 w后，移植組心肌纖維化、心肌細胞肥大及重構(gòu)程度較模型組輕。模型組（圖3F）膠原容積分數(shù)為55.60±3.65，心肌組織間質(zhì)內(nèi)可見大量的膠原纖維，無心肌細胞再生。移植組（圖3E）心肌間質(zhì)中膠原纖維明顯減少，心肌細胞在瘢痕組織中少量再生，膠原容積分數(shù)為35.71±4.88，低于模型組（P＜0.01）。而正常組心肌纖維排列整齊，心肌纖維化少見，膠原容積分數(shù)僅為0.31±0.09（圖3D）。正常組大鼠（圖3G）心肌細胞凋亡率為（1.53±0.69）%。模型組大鼠 （圖3I）心肌組織心肌細胞凋亡率為（43.61±4.88）%，高于正常組（P＜ 0.01）。 移植組（圖3H） 凋亡率為 （23.55±3.62）%， 低于模型組 （P＜0.01）。

2.5 各組心肌CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達水平比較 正常組、移植組、模型組心肌CollagenⅠ基因的mRNA相對表達量分別為0.03±0.01、0.52±0.31、2.12±0.98，CollagenⅢ基因的 mRNA 相對表達量分別為 0.08±0.05、0.80±0.45、2.69±2.38。模型組心肌CollagenⅠ和CollagenⅢ的mRNA表達水平高于正常組及移植組（P＜0.05），而正常組與移植組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖 4。

3 討論

圖2 EGFP標記BMSC在心肌內(nèi)的分布

圖3 各組大鼠心肌組織病理染色結(jié)果

注：與正常組、移植組比較，①P＜0.05

心肌纖維化是心肌修復的主要病理表現(xiàn)，可以導致心臟僵硬度增加，心臟順應性降低，心臟傳導阻滯，心肌收縮及舒張功能障礙，最終導致心力衰竭的發(fā)生[2-3]。MSC移植后可在心肌缺血微環(huán)境下分化為心肌細胞，分泌促細胞及血管生成因子，抑制心肌細胞凋亡，增加心肌灌注，減少心肌細胞外基質(zhì)沉積，改善心肌重構(gòu)，提高心功能[4-5]，但其機制目前尚不明了。

本研究采用BMSC移植治療慢性心衰大鼠4 w后，大鼠心肌Collagen I和CollagenⅢ mRNA的表達量明顯減少，提示BMSC移植后顯著抑制心肌纖維化的作用，這可能是抑制心肌纖維化的機制之一。超聲心動圖結(jié)果顯示,BMSC治療后4 w,大鼠心臟LEVF有顯著增加，收縮功能明顯改善，心功能改善，而模型對照大鼠的收縮功能進一步下降。病理組織學檢測顯示,BMSC治療后4 w，大鼠心肌細胞肥大及心肌細胞凋亡率明顯降低，心肌細胞數(shù)量增加，心肌間質(zhì)膠原沉積減少。這些結(jié)果表明，BMSC治療能明顯改善心衰大鼠心衰癥狀，使大鼠心重/體重指數(shù)減小，呼吸及心率減慢，體重增加。

綜上所述，BMSC移植治療可改善慢性心衰大鼠心肌重構(gòu)，使心肌細胞凋亡減少，瘢痕組織形成減少，間質(zhì)膠原沉積減輕，這可能是其抑制心肌纖維化的機制之一。

[1] Favreau AJ,Ryzhov S,Sawyer DB.Novel biological therapies targeting heart failure:myocardial rejuvenation[J].Heart Fail Clin,2016,12(3):461-471.

[2] Davide Lazzeroni,Ornella Rimoldi,Paolo G Camici.From left ventricular hypertrophy to dysfunction and failure[J].Circulation Journal,2016,80(3):555-564.

[3] 雷川云,柯亭羽,徐勉.干細胞移植治療2型糖尿病急性心肌梗死的研究進展[J].中國醫(yī)藥科學,2013,3(19):36-38.

[4] Silva GV,Litovsky S,Assad JA,et al.Msesnchymal stemcells differentiate into an endothelial phenotype,enhance vascular density,and improve heart function in a canine chronic ischemia mode[J].Circulation,2005,111(2):150-156.

[5] Li L,Zhang Y,Li Y,et al.Mesenchymal stem cell transplantation attenuates cardiac fibrosis associated with isoproterenol induced global heart failure[J].European Society for Organ Transplantation,2008,21(12):1181-1189.