細胞自噬在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用

魏凡華 ， 許立華

(寧夏大學農(nóng)學院 , 寧夏 銀川 750021)

結(jié)核病是嚴重危害人類健康的一種感染性疾病，其主要病原體是抗酸性棒狀結(jié)核分枝桿菌。1998年世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計結(jié)果表明，全世界約有1/3的人口受到結(jié)核桿菌的潛在感染[1]。盡管只有一小部分的潛伏感染人口會發(fā)展成結(jié)核病，這仍然意味著每年將增加800萬結(jié)核病例和導致大約150萬結(jié)核病人死亡。結(jié)核病是死亡率排在第二的傳染性疾病。我國衛(wèi)生部對結(jié)核病的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國結(jié)核病的疫情相當嚴峻，并且呈上升趨勢。而且，在新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核病病例中，存在著多重耐藥(Multidrug-resistant，MDR)和廣泛耐藥(Extensively drug-resistant，XDR)現(xiàn)象。

自噬是真核生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程。該過程中一些損壞的胞質(zhì)組分或細胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體或液泡中進行降解并得以循環(huán)利用。根據(jù)細胞物質(zhì)運送到溶酶體內(nèi)方式的不同，自噬可分為巨自噬、分子伴侶介導的自噬和小自噬。通常所說的自噬指的是巨自噬，依賴于自噬相關(guān)基因(Autophagy-related gene，Atg)的激活。自噬過程可以分為3個階段：(1)啟動階段：自噬小泡膜開始形成，起始階段的關(guān)鍵分子是mTOR激酶，可以感受細胞內(nèi)氨基酸和ATP的數(shù)量從而控制細胞的自噬活性；(2)延長階段:自噬小泡膜彎曲、延伸，形成吞噬體膜以包裹吞噬的成分。泛素樣結(jié)合系統(tǒng)參與自噬小泡膜的延伸，目前發(fā)現(xiàn)有兩個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)：Apg12/Apg5系統(tǒng)和Apg8及其靶向分子磷脂酰乙醇胺；(3)成熟階段：包括晚期內(nèi)涵體與溶酶體的融合及自噬體的降解。巨自噬與結(jié)核分枝桿菌的感染尤為密切。本文將重點對自噬在抵御結(jié)核分枝桿菌感染中的當前研究狀況進行綜述。

1 細胞自噬與抵御病原體感染

多種因素的刺激均可以誘導細胞自噬的發(fā)生，例如低氧環(huán)境、氧化應激、病原微生物感染和藥物處理。機體可以通過細胞自噬作用降解損傷的細胞器、蛋白沉積物和胞內(nèi)病原微生物等，從而維持細胞自穩(wěn)。自噬相關(guān)(ATG)蛋白在調(diào)節(jié)細胞自噬中起著重要的作用，包括自噬的啟動、自噬小體和溶酶體的融合等。常見的ATG蛋白包括：(1))ULK激酶復合物，包括ULK1、ULK2和ATG13等，被AMP激酶(自噬的正調(diào)控因子)和 mTOR (雷帕霉素的藥物靶點，自噬的負調(diào)控因子)所調(diào)控；(2)PI3K復合物，包括VPS34、ATG6 (也稱為Beclin-1)、ATG14 (也稱為Barkor)和VPS15蛋白，參與自噬小體的成核；(3)ATG9，自噬小體形成過程中提供脂質(zhì)雙層；(4)ATG12-ATG5-ATG16L1復合體；(5)泛素樣微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (The ubiquitin-like microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)。ATG12-ATG5-ATG16L1復合體可以發(fā)揮E3 連接酶的作用，指導胞質(zhì)型LC3的C末端與磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，產(chǎn)生胞膜型LC3-II 形式，形成雙層膜的自噬小體，引發(fā)自噬小體與溶酶體的融合，形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物。

自噬是細胞阻斷病原體利用宿主細胞而生長繁殖的手段，是宿主細胞抵御病原體感染的重要機制。宿主細胞可以通過自噬抵御多種病原微生物的感染，包括細菌、真菌、原生動物和病毒等。宿主細胞的大分子或細胞膜被泛素或半乳凝集素所標記，進而被自噬接頭蛋白所識別，例如P62、NBR1、泛素化自噬受體蛋白OPTN或CALCOCO2(Calcium binding and coiled-coil domain 2，CALCOCO2)等，最后在溶酶體中被降解。然而，部分細菌通過分泌效應分子調(diào)控自噬信號通路，逃脫自噬介導的降解[2]。

2 細胞自噬與抵御結(jié)核分枝桿菌感染

2.1 細胞自噬與結(jié)核分枝桿菌感染存在遺傳相關(guān)性 研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬與結(jié)核分枝桿菌感染之間存在著遺傳學上的相關(guān)性。全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study，GWAS)表明炎性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)和結(jié)核病之間存在著易感基因的遺傳重疊。最先研究認為，ATG16L1和IRGM基因多態(tài)性和IBD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IRGM基因多態(tài)性和結(jié)核分枝桿菌感染存在基因關(guān)聯(lián)性。IRGM基因可以刺激已感染巨噬細胞中吞噬小體的成熟和細胞自噬，誘導結(jié)核分枝桿菌的清除。IRGM基因缺失的情況下，小鼠不能有效地清除體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌[3]。在不存在25-羥膽鈣化(甾)醇的條件下，維生素D受體的基因多態(tài)性和結(jié)核分枝桿菌感染的易感性存在遺傳關(guān)聯(lián)[4]。此外，TLR2基因多態(tài)性也是結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的易感位點，TLR2激活后可以通過活化p38信號通路而誘導細胞自噬。

2.2 細胞自噬與天然免疫信號通路 細胞自噬是天然免疫應答的一個重要組成部分，但其活化的信號通路還不十分清楚[5]。已有研究表明，模式識別受體可以激活自噬的發(fā)生，通過TRAF6激活或穩(wěn)定Beclin-1 和ULK1的水平[6]，誘導宿主天然免疫應答，克服結(jié)核分枝桿菌感染導致的吞噬小體成熟的靜止。TLR2、TLR4和TLR9在識別結(jié)核分枝桿菌，刺激產(chǎn)生抗結(jié)核分枝桿菌的效應分子和細胞因子，以及誘導吞噬小體成熟、激活細胞自噬和殺滅病原菌中發(fā)揮重要的作用[7-8]。最近研究證實，TLR7也參與抗結(jié)核分枝桿菌感染，上調(diào)TLR7能夠增加被感染細胞的存活和上調(diào)LC3-II的水平[9]。而且，TLR信號通路的一些其他關(guān)鍵分子也參與調(diào)節(jié)了細胞自噬的激活，例如MyD88、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)和MAPK激酶。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的部分編碼分子可以調(diào)控細胞自噬。結(jié)核分枝桿菌19 KDa的脂蛋白可以通過TLR2通路激活單核細胞和巨噬細胞中的自噬反應。EIS抗原蛋白可以介導細胞和NADPH氧化酶源的ROS生成[10]，上調(diào)IL-10水平和激活Akt/mTOR/p70S6K通路[11]，從而抑制宿主細胞自噬的發(fā)生。EIS蛋白還具有N-乙?；D(zhuǎn)移酶的作用，可以引發(fā)雙特異性磷酸酶DUSP16(Dual-specificity protein phosphatase 16，DUSP16)/MAPK磷酸酶7(MKP-7)55位Lys的乙酰化反應，由于DUSP16/MKP-7是JNK特異的磷酸化酶，因此抑制了JNK的磷酸化和炎性因子的產(chǎn)生[12]。此外，模式識別受體NOD2 可以通過受體相互作用絲蘇氨酸激酶2(Receptor interacting protein kinase 2 ，RIPK2)和ULK1的激活，激活宿主細胞自噬[13]。結(jié)核分枝桿菌胞壁酰二肽可以作為NOD2的配基，通過RIPK-2、ATG5、ATG7和ATG16L1，形成吞噬小體[14]。肺泡巨噬細胞中NOD2的激活，誘導IRGM、LC3和ATG16L1基因的表達，促進宿主細胞自噬的發(fā)生，有助于下調(diào)結(jié)核分枝桿菌的毒力。體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明，NOD2基因缺失小鼠在受到結(jié)核分枝桿菌MDP刺激后，NF-κB激活和IL-1β水平明顯上調(diào)[15]，不能有效地募集ATG16L1蛋白和誘發(fā)宿主細胞自噬，這說明NOD2介導的自噬通路有助于殺滅病原菌和維持宿主免疫自穩(wěn)。此外，胞內(nèi)病原體DNA刺激產(chǎn)生的環(huán)化二核苷酸GMP-AMP(cGAMP)和細菌分泌的環(huán)鳥苷二磷酸(Cyclic-di-GMP 和Cyclic-di-AMP)也可以誘導宿主細胞自噬和ULK1激活[16]。抑制主要組織相容性復合體(MHC)的抗原遞呈，也是結(jié)核分枝桿菌免疫逃避的重要機制[17]。由此可見，對于結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)配基以及抗原蛋白調(diào)節(jié)宿主細胞自噬的認識，有助于研發(fā)用于控制和預防結(jié)核病的治療藥物和疫苗。

2.3 細胞自噬與細胞因子 誘導產(chǎn)生細胞因子是宿主抵御結(jié)核分枝桿菌感染的重要機制。研究已經(jīng)證實，部分保護性細胞因子可以激活宿主細胞自噬，促進抗結(jié)核分枝桿菌免疫應答。Th1型細胞因子IFN-γ在激活自噬介導的結(jié)核分枝桿菌清除中發(fā)揮重要的作用，而Th2 型細胞因子IL-4和IL-13可以抑制IFN-γ依賴的自噬激活[18]。IL-4和 IL-13抑制IFN-γ介導細胞自噬的信號通路依賴于STAT6，而抑制饑餓誘導細胞自噬的信號通路依賴于Akt信號。IFN-γ增強了宿主細胞通過自噬反應對結(jié)核分枝桿菌的清除，這和誘導產(chǎn)生誘導型一氧化氮合成酶2、干擾素誘導的GTPase 家族LRG47等抗菌效應分子以及上調(diào)MHC II分子有關(guān)。TNF-α可以促進IFN-γ介導的抗菌應答和自噬反應[19]。其他一些細胞因子，例如IL-17，上調(diào)MAPK1/3信號通路，正調(diào)控宿主細胞的自噬反應[20]。

細胞因子的產(chǎn)生和自噬反應的激活是相互調(diào)控的，細胞因子可以調(diào)控自噬反應，同樣地細胞自噬也可以調(diào)控細胞因子的水平。例如，細胞自噬可以上調(diào)TNF-α的表達和產(chǎn)生，下調(diào)部分細胞因子的轉(zhuǎn)錄、加工和分泌，包括IL-1α、IL-1β、I型干擾素和IL-18。自噬反應下調(diào)IL-1β的水平與促進pro-IL-1β降解和抑制AIM2 和 NLRP3炎性小體激活有關(guān)[21-22]。宿主細胞自噬反應防止了缺陷線粒體的積累，減少了ROS的產(chǎn)生和線粒體DNA(mtDNA)的釋放。ROS可以激活NLRP3，mtDNA則激活AIM2，從而上調(diào)IL-1β的加工和分泌。IL-1α和IL-1β都有助于機體抵御結(jié)核分枝桿菌的感染，但是過度的IL-1α產(chǎn)生將會導致炎癥和病理損害，例如Th17功能紊亂和肺部組織壞死[23]。

2.4 宿主細胞通過自噬反應抵御結(jié)核分枝桿菌的機制 宿主細胞通過自噬反應殺滅胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的機制與自噬溶酶體獨特的降解作用和抗菌特性有關(guān)，這種降解作用和抗菌特性遠強于普通的吞噬體。細胞自噬可以促進吞噬小體的進一步成熟，克服由于結(jié)核分枝桿菌感染導致的吞噬小體成熟受阻。吞噬小體也可以直接捕獲一部分胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，發(fā)展成為具有降解功能的自噬溶酶體[24]。細胞自噬也可以促進抗結(jié)核分枝桿菌多肽(例如組織蛋白酶抑制劑等)和溶酶體的融合。此外，細胞自噬促進結(jié)核分枝桿菌蛋白的泛素化和靶向溶酶體的輸送[25]，生成和輸送新生抗菌肽[21, 26]。結(jié)核分枝桿菌感染轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)試驗表明，自噬反應可以有效保護機體病原菌感染、炎癥應答、肺組織病理學和死亡率。Atg5fl/flLysM-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠髓系細胞中缺乏自噬相關(guān)基因，結(jié)核分枝桿菌Erdman株感染后，Atg5fl/flLysM-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的細菌負載量和死亡率明顯增加[24]。總之，生理學和免疫學因素刺激觸發(fā)的細胞自噬激活均可以殺滅胞內(nèi)感染的結(jié)核分枝桿菌。

3 細胞自噬與結(jié)核病治療

不難看出，細胞自噬在抗結(jié)核分枝桿菌的宿主免疫應答中發(fā)揮重要的作用。結(jié)核分枝桿菌毒力蛋白通過阻斷，自噬小體與溶酶體的融合，促進結(jié)核分枝桿菌的體內(nèi)生長[27]。因此，細胞自噬的誘導劑有用于治療結(jié)核病的潛力。已有研究表明，硝唑尼特可以有效抑制雷帕霉素靶蛋白的復合體1(Mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)信號通路和強烈地誘導自噬反應[28]。硝唑尼特的良好治療效果可能與直接殺滅復制和非復制的結(jié)核分枝桿菌，以及誘導吞噬細胞的自噬反應有關(guān)。采用5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)處理結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞，能夠強烈地激活自噬反應，有效地抑制胞內(nèi)病原菌的生長[29]。這依賴于AMPK誘導的mTOR抑制和AMPK誘導的過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PPARGC1A)上調(diào)，從而導致轉(zhuǎn)錄因子CEBPB調(diào)控的自噬相關(guān)基因表達增加和自噬反應激活[29]。激活細胞自噬的免疫佐劑也可能用于結(jié)核病的治療。IFN-γ可以激活細胞自噬，輸送結(jié)核分枝桿菌到溶酶體。乳酸菌通過上調(diào)IFN-γ以及下調(diào)IL-4和IL-13，增強了單核吞噬細胞的體外殺菌能力[30]。此外，其他一些激活細胞自噬的藥物也有用于治療結(jié)核病的潛力，例如，作用于三磷酸肌醇通路的藥物；抑制HMG-CoA還原酶的藥物；RAC1-mTOR通路的抑制藥物；包括結(jié)核分枝桿菌基因的DNA疫苗等。

4 展望

細胞自噬是宿主細胞自主進行的天然免疫防御機制，在抵御胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌感染中具有重要的作用。在結(jié)核分枝桿菌感染中，免疫應答與細胞自噬存在著信號通路的交聯(lián)，細胞因子與細胞自噬也存在著相互調(diào)控，因此，進一步解析細胞自噬通路在宿主抗結(jié)核分枝桿菌免疫應答中作用，對以自噬通路為靶標來預防和治療結(jié)核分枝桿菌感染將具有深遠的意義。

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