糖尿病皮膚潰瘍干細(xì)胞治療及作用機(jī)制的研究進(jìn)展*

石秀君， 聶緒強(qiáng), 2△， 趙久鳳， 陳 宇

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1藥學(xué)院， 2院士工作站， 貴州 遵義 563000)

在我國，糖尿病患者的數(shù)量逐年增多，過去20年里，我國糖尿病患病人數(shù)呈爆炸式增長。據(jù)估計(jì)，截止到2017年全球患病人數(shù)約為4.25億，預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到6.29億。我國是全球糖尿病人數(shù)最多的國家，2017年糖尿病人數(shù)為1.14億，預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到 1.5億左右。糖尿病皮膚潰瘍(diabetic cutaneous ulcers，DCU)是指糖尿病患者由于長期血糖控制不良，進(jìn)而引起神經(jīng)病變及不同程度的各種末梢血管病變而導(dǎo)致下肢感染、潰瘍形成和/或深部組織的破壞。調(diào)查顯示，大約60%的非創(chuàng)傷性小腿截肢是由糖尿病引起的，DCU是糖尿病患者致死致殘的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的藥物治療、血管搭橋術(shù)、經(jīng)皮內(nèi)血管形成手術(shù)和支架置入術(shù)等方法都有其局限性[1]。由于干細(xì)胞具有高度分化和增殖潛能，其在糖尿病治療中的作用逐漸凸顯出來，目前干細(xì)胞移植治療DCU已經(jīng)部分應(yīng)用于臨床，但不同類型干細(xì)胞對DCU的治療作用、具體的機(jī)制及臨床有效性等需要進(jìn)一步探討。本文就此對近年來國內(nèi)外不同來源干細(xì)胞治療DCU的作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 DCU的發(fā)病機(jī)制

DCU是糖尿病患者由于神經(jīng)血管病變導(dǎo)致微循環(huán)障礙而發(fā)生的潰瘍和壞疽，是神經(jīng)病變、血管病變和感染共同作用的結(jié)果，一種病變引起另一種病變，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致病情加重。DCU分為神經(jīng)性和缺血性，也有神經(jīng)缺血混合性，感染是最后共同的途徑。對于糖尿病患者，由于機(jī)體長期處于高糖環(huán)境中，導(dǎo)致內(nèi)源性一氧化氮(nitric oxide，NO)不足，在高糖環(huán)境下白細(xì)胞功能缺陷，引起免疫應(yīng)答不足。同時(shí)，新生血管缺乏，創(chuàng)面頑固性細(xì)菌感染，皮膚真皮層細(xì)胞新生刺激或分化不良都是造成DCU難以愈合的原因[2]。

1.1神經(jīng)病變 隨著糖尿病發(fā)病率的上升，周圍神經(jīng)病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率也相應(yīng)增加。據(jù)估計(jì)，約50%的糖尿病患者由于疾病持續(xù)時(shí)間長和未得到有效控制而發(fā)展成神經(jīng)病變。糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathies，DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是截肢的主要原因[3]。DPN是糖尿病患者神經(jīng)功能紊亂引起的疾病，伴有疼痛的遠(yuǎn)端對稱多神經(jīng)病變(distal symmetrical polyneuropathy，DSPN)約占糖尿病患者的20%；糖尿病自主神經(jīng)病變(diabetic autonomic neuropathy，DAN) 是DPN最常見的表現(xiàn)，主要影響血管的收縮和舒張功能，皮膚血流的自我調(diào)節(jié)能力降低、汗液脂腺分泌減少，導(dǎo)致皮膚干燥，造成局部感染[4]。DPN患者對皮膚損傷的敏感性減低，感覺遲鈍甚至喪失，患者在活動(dòng)過程中易導(dǎo)致皮膚損傷，潰瘍加深，最后導(dǎo)致組織損傷，給患者的生活甚至休息帶來不良影響[5]。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變主要是引起糖尿病足患者足部腓腸肌群神經(jīng)支配不平衡，導(dǎo)致足部變形，在不合適的鞋襪作用下容易引起足部損傷，易發(fā)生細(xì)菌入侵[6]。

1.2血管病變 糖尿病導(dǎo)致的血管病變常累及動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管，造成管腔狹窄、粥樣硬化、血管閉塞而引起潰瘍。糖尿病血管病變分為大血管病變和微血管病變。大血管病變主要引起動(dòng)脈粥樣硬化，形成斑塊，血管壁增厚，血管腔變窄甚至堵塞，導(dǎo)致供血不足，形成缺血性潰瘍[7]；微血管病變主要表現(xiàn)為微血管基膜增厚，舒縮功能紊亂，特別是在神經(jīng)病變的作用下，造成組織缺血，肢體遠(yuǎn)端血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致局部感染[8]。血管病變引起的微血管和微循環(huán)不同程度的障礙是造成遠(yuǎn)端缺血和組織損傷的主要原因。糖尿病患者代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致血液的理化性質(zhì)改變，出現(xiàn)持續(xù)的高黏和高凝狀態(tài)。機(jī)體長期的高血糖狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致上皮功能障礙和白細(xì)胞功能缺陷，造成內(nèi)源性NO減少，導(dǎo)致免疫功能障礙，免疫應(yīng)答不足，在諸多因素聯(lián)合作用下使患者病情加重[9]。

1.3感染性糖尿病足 患者由于神經(jīng)病變和血管病變極易感染，而感染會(huì)導(dǎo)致患者的病情加重。 糖尿病患者免疫功能異常，對感染反應(yīng)減弱，一般不會(huì)出現(xiàn)紅腫等感染跡象，不易察覺，加之神經(jīng)病變和血循環(huán)障礙，病情將進(jìn)一步惡化，導(dǎo)致截肢甚至危及生命。

2 干細(xì)胞治療DCU的研究進(jìn)展

干細(xì)胞是一類具有極強(qiáng)的自我更新和自我復(fù)制能力的細(xì)胞，具有多向分化潛能，在特定的條件下能分化為各種細(xì)胞、組織和器官，被醫(yī)學(xué)界稱之為“萬能細(xì)胞”。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)，ESCs具有全能性，能分化成體內(nèi)各種組織和器官；而ASCs分化潛能較弱，只能分化成為特定的細(xì)胞組織[10]。

傳統(tǒng)治療糖尿病足的手段主要包括內(nèi)科藥物治療、外科手術(shù)治療和介入治療。由動(dòng)脈閉塞引起下肢缺血的患者，血管病變嚴(yán)重，藥物保守治療已不再適用，需要進(jìn)行手術(shù)治療或介入治療。但糖尿病患者大多年老體弱，且往往伴隨其它疾病，也有一部分患者由于缺乏遠(yuǎn)端動(dòng)脈流出道，不具備手術(shù)搭橋和介入療法的條件。由于近年來干細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞治療作為一種新型療法，為這類糖尿病患者帶來了希望。通過干細(xì)胞的方法治療DCU，主要是由于干細(xì)胞能分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)和平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，SMCs)，形成新的毛細(xì)血管，同時(shí)干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子可以促進(jìn)組織修復(fù)，改善和恢復(fù)下肢血流，促進(jìn)新生血管生成，達(dá)到治療DCU的目的。

2.1ESCs與DCU的治療 ESCs是處于胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞，無論在體內(nèi)體外都能被誘導(dǎo)分化成為各種類型的細(xì)胞。目前的科學(xué)研究中，主要是將ESCs誘導(dǎo)分化成為胰島素分泌細(xì)胞，通過改善糖尿病患者胰島素分泌不足的情況而治療DCU，同時(shí)胎盤干細(xì)胞分化成熟度低、增殖能力強(qiáng)，對于混合性原因引起的DCU有很好的治療作用[10]。黃錦桃等[11]在體外培養(yǎng)ESCs并誘導(dǎo)其分化為表皮干細(xì)胞，將帶有核熒光標(biāo)記的ESCs源性表皮干細(xì)胞以生物膜為載體，覆蓋于小鼠皮膚表面全層皮膚缺損處，術(shù)后取材，由HE染色，蘇丹Ⅲ染色以及免疫組化雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)，ESCs源性表皮干細(xì)胞在全層皮膚缺損處有分化為汗腺樣、表皮樣、毛囊樣和皮脂腺樣結(jié)構(gòu)的潛能。在含有特定生長因子的特定培養(yǎng)基中，ESCs可以分化為角質(zhì)化細(xì)胞，這些角質(zhì)化細(xì)胞可以在培養(yǎng)過程中形成多層表皮，成為生物工程皮膚的關(guān)鍵細(xì)胞類型[12]。ESCs具有多能性和無限擴(kuò)增能力，但由于分化難以控制易導(dǎo)致畸形，同時(shí)，提取分離ESCs要破壞胚胎，使其在倫理學(xué)和法律等方面受到限制，制約了ESCs的研究發(fā)展。

2.2間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)與DCU的治療 MSCs是來源于中胚層的細(xì)胞，具有多向分化潛能，于20世紀(jì)60年代首次從骨髓中被鑒定，在骨髓中含量最豐富，也存在于臍血、外周血和脂肪等部位。間充質(zhì)干細(xì)胞能旁分泌血管生成素1和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促進(jìn)血管生成的血管生長因子，還能促進(jìn)細(xì)胞向創(chuàng)傷部位遷移，形成肉芽組織，此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞參與傷口表皮的形成，對DCU的愈合有很好的治療作用[13]。

2.2.1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)與DCU的治療 UC-MSCs是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[14]。臍帶干細(xì)胞原始，不引起社會(huì)倫理問題，糖尿病皮膚潰瘍局部移植UC-MSCs，促進(jìn)創(chuàng)面干燥、結(jié)痂，組織再生和愈合。何晏清等[15]以100例2型糖尿病皮膚潰瘍患者，隨機(jī)分為觀察組和對照組，觀察組應(yīng)用UC-MSCs移植治療，對照組給予常規(guī)處理，可以發(fā)現(xiàn)觀察組的愈合效率明顯高于正常組。徐海環(huán)等[16]在Sprague-Dawley 大鼠建立DCU模型后，用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞上清提取物作用于潰瘍處，發(fā)現(xiàn)與模型組和對照組比較，有效降低腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)及提高VEGF的表達(dá)水平。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，53例糖尿病足潰瘍患者給予血管形成術(shù)介入治療后，25例患者作為對照組，28例患者在介入治療后進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)移植，3個(gè)月后隨訪發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組患者的傷口愈合情況、踝肱指數(shù)的壓力和經(jīng)皮氧壓力都較對照組更好，且新生血管數(shù)較對照組更多，無不良反應(yīng)[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，SD大鼠DCU模型中給予HUCMSCs移植治療，結(jié)果顯示，細(xì)胞角蛋白K19表達(dá)量增加，潰瘍愈合情況較對照組好，膠原表達(dá)增多，細(xì)胞上皮化[17]。

2.2.2臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)與DCU的治療 UCB-MSCs具有相似的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面抗原，以及分化為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)和UC-MSCs的潛力，有較短的倍增時(shí)間，較長的存活時(shí)間和較好的抗炎活性。Xia等[14]用UCB-MSCs治療糖尿病足大鼠，治療組大鼠血液中神經(jīng)因子(nerve growth factor，NGF)表達(dá)增高，股神經(jīng)的傳導(dǎo)速度顯著恢復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UCB-MSCs通過促進(jìn)大鼠糖尿病皮膚潰瘍處血管生成和NGF的表達(dá)促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。You等[18]發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)人體UCB-MSCs、糖尿病及正常人皮膚成纖維細(xì)胞，UCB-MSCs產(chǎn)生的纖維母細(xì)胞生長因子和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的能力均優(yōu)于2個(gè)成纖維細(xì)胞組，UCB-MSCs膠原合成的能力優(yōu)于糖尿病成纖維細(xì)胞組但弱于正常成纖維細(xì)胞組，提示比起膠原合成，UCB-MSCs在糖尿病創(chuàng)傷愈合方面具有更大潛力，尤其在血管生成中發(fā)揮重要作用。但由于隱私和倫理問題，并且UCB-MSCs保存費(fèi)用昂貴，所以UCB-MSCs在治療糖尿病皮膚潰瘍中并未得到廣泛應(yīng)用。

2.2.3BM-MSCs與DCU的治療 骨髓是獲得間充質(zhì)干細(xì)胞最常見的來源之一，BM-MSCs是存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，對造血干細(xì)胞具有機(jī)械支撐作用，可以分泌多種生長因子支持造血干細(xì)胞造血，還可以分化成骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，并可以誘導(dǎo)分化為胰腺分泌細(xì)胞，應(yīng)用前景廣泛。有文獻(xiàn)表明，BM-MSCs可以分化為真皮層的成纖維細(xì)胞，或分泌多種細(xì)胞因子，通過促進(jìn)膠原合成，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[19]。BM-MSCs沒有免疫限制，不會(huì)刺激同種異體反應(yīng)，可以促進(jìn)細(xì)胞遷徙，促進(jìn)血管生成，并促進(jìn)旁分泌加速創(chuàng)傷愈合。Iwamoto等[20]證實(shí)，通過全身注射粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)，從骨髓中動(dòng)員的自體干細(xì)胞可以改善臨床患者的傷口愈合情況并發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)小鼠傷口愈合，可能是由于G-CSF促進(jìn)骨髓源性干細(xì)胞動(dòng)員和遷移到傷口部位，并改善肉芽組織，以增強(qiáng)上皮化。自體干細(xì)胞移植可以顯著改善臨床參數(shù)，包括減少傷口大小，維持正常肝和腎功能，腿部灌注也得到充分的改善，減少了主要的截肢手術(shù)。故有研究發(fā)現(xiàn)將自體移植物與BM-MSCs結(jié)合，發(fā)現(xiàn)可減少傷口的大小，增加皮膚的血管舒張和厚度[21]。Amini等[22]在1型糖尿病潰瘍大鼠模型給予藥物治療，RT-PCR結(jié)果顯示BM-MSCs治療組的堿性成纖維細(xì)胞生長因子1α(basic fibroblast growth factor，bFGF)、低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)表達(dá)水平均高于安慰劑組，BM-MSCs聯(lián)合光生物調(diào)節(jié)較單獨(dú)治療對1型糖尿病潰瘍大鼠具有更好的作用。

2.2.4脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cells，A-MSCs)與DCU的治療 A-MSCs是由Feng等[23]首次從人脂肪組織中分離出的脂肪干細(xì)胞，A-MSCs 與BM-MSCs形態(tài)相似，來源廣泛，能大量獲取。A-MSCs可分化為內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，并有分泌多種細(xì)胞因子的能力。有研究表明，在DCU小鼠模型中，與磷酸鹽緩沖鹽處理的相比，用微?；闹炯?xì)胞基質(zhì)治療的皮膚傷口明顯加速愈合。微?；闹炯?xì)胞基質(zhì)在缺血性糖尿病潰瘍中有加速創(chuàng)傷愈合的潛力，可能提供一種簡單、安全、微創(chuàng)的組織修復(fù)和恢復(fù)的方法。Seo等[24]在DCU小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，給予A-MSCs和醋酸艾塞那肽聯(lián)合治療，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。

2.3表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells)與DCU的治療 表皮干細(xì)胞作為皮膚組合特異性細(xì)胞，不僅維持著表皮日常的新陳代謝，且積極參與皮損后的修復(fù)。表皮干細(xì)胞來源于胚胎的外胚層，在胎兒時(shí)期主要位于初級表皮層，成人時(shí)位于表皮基底層和毛囊凸起部位，小鼠皮脂腺底部也發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞的存在[25]。表皮干細(xì)胞的位置相對穩(wěn)定，位于毛囊隆突處，可用表皮干細(xì)胞特征標(biāo)志物K19進(jìn)行檢測。在皮膚創(chuàng)傷愈合的過程中，創(chuàng)面再上皮化是創(chuàng)傷愈合的標(biāo)志。有研究表明，創(chuàng)面的表皮細(xì)胞可去分化成表皮干細(xì)胞，在機(jī)體的微環(huán)境的誘導(dǎo)下，表皮干細(xì)胞可再分化成表皮細(xì)胞和毛囊、汗腺等皮膚附屬器促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合[26]。

2.4單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)與DCU的治療 MNCs包括骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)和外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PB-MNCs)。BM-MNCs是指骨髓中具有單個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞的總稱，是具有自我更新和分化能力的原始骨髓細(xì)胞；PB-MNCs是外周血中具有單個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。黃平平等[27]首次報(bào)道了動(dòng)員自體外周血干細(xì)胞移植治療下肢缺血的臨床研究，1例下肢閉塞性動(dòng)脈硬化(arteriosclerosis obliterans)患者接受自體外周血干細(xì)胞移植后，疼痛，間歇性跛行，患肢冷感和潰瘍等明顯好轉(zhuǎn)，移植一個(gè)月后，末梢血流波幅和激光多普勒掃描血流灌注量較移植前顯著改善，且患者未出現(xiàn)移植相關(guān)的并發(fā)癥和不良反應(yīng)。El-Mesalamy等[28]發(fā)現(xiàn)，在大鼠模型中，用人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(human umbilical cord blood mononuclear cells，HUCB-MNCs)和人臍帶血透析液(human umbilical cord blood haemodialysate，HUCB-HD)治療DCU會(huì)導(dǎo)致傷口收縮，增加過氧化氫酶、NO、血小板數(shù)、體重和羥脯氨酸，降低葡萄糖和丙二醛的含量。Trignano等[29]報(bào)道了一位61歲的糖尿病男性患者，進(jìn)行MNCs移植治療之后，踝關(guān)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)速度改善，患者的傷口愈合明顯改善；6個(gè)月后隨訪，無復(fù)發(fā)跡象。

2.5內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)與DCU的治療 EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞, 是骨髓產(chǎn)生的原始細(xì)胞，能定向向缺血部位趨化，通過自身的分化、增殖, 形成新生血管，從而改善肢體缺血狀態(tài)。Dubsky等[30]在50例糖尿病患者中隨機(jī)挑選28例糖尿病患者，17例用BM-MNCs進(jìn)行治療，11例用外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(peripheral blood endothelial progenitor cells，PB-EPCs)治療，22例糖尿病患者選為對照組，采用保守治療。結(jié)果顯示6個(gè)月后，在2個(gè)細(xì)胞治療組，經(jīng)皮氧氣壓力比基線顯著增加，這2組之間無顯著差異；細(xì)胞治療組截肢率顯著降低，2個(gè)細(xì)胞治療組無顯著差異；BM-MNCs和PB-EPCs組血清細(xì)胞生成因子無明顯差異。研究說明與保守治療相比，BM-MNCs和PB-EPCs治療組有明顯優(yōu)勢，并且2種方法無明顯差異。Zhao等[31]將胎兒主動(dòng)脈來源的EPCs移植到DCU大鼠模型中，血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子1(endothelial leukocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)表達(dá)水平增高，CD133表達(dá)水平明顯降低，DCU大鼠進(jìn)行細(xì)胞移植治療后，溫度、血流量、血氧飽和度等都逐漸恢復(fù)，缺血性癥狀改善。

3 干細(xì)胞治療DCU的機(jī)制研究

3.1Wnt信號通路在干細(xì)胞治療DCU中的作用 Wnt/β-catenin途徑是Wnt信號通路經(jīng)典途徑。Wnt 蛋白與細(xì)胞表面受體Frizzled和 LRP5/6 結(jié)合后活化胞質(zhì)內(nèi)蓬亂蛋白(Dishevelled，Dvl)，并抑制下游蛋白復(fù)合物，使 β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定存在，部分β-catenin進(jìn)入核內(nèi)與T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(T-cell factor/lymphoid enhancing factor，TCF/LEF) 相互作用，活化下游靶基因的表達(dá)[32]。張季林等[33]發(fā)現(xiàn)，白花檵木醇提物(ethanol extract ofLoropetalumchinensis，EELC)激活經(jīng)典Wnt信號通路，促使β-catenin關(guān)鍵蛋白積累，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游特異靶基因表達(dá)，促進(jìn)ESCs 增殖、分化，有效地修復(fù)糖尿病潰瘍皮膚創(chuàng)面。鐘清玲等[34]發(fā)現(xiàn)，表皮干細(xì)胞移植可有效促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合，且β-catenin表達(dá)增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病皮膚潰瘍的糖尿病患者和小鼠中，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF) 表達(dá)水平增高，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)PEDF導(dǎo)致創(chuàng)傷愈合延遲，由半乳糖苷染色和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DCU小鼠中PEDF抑制Wnt信號通路，提示PEDF可能通過抑制Wnt信號通路延遲DCU愈合[30]。

3.2PI3k/Akt信號通路在干細(xì)胞治療DCU中的作用 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)具有Ser/Thr激酶活性；Akt又稱蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)，是PI3K信號通路下游的重要靶蛋白，有3個(gè)亞型，其中Akt2主要表達(dá)于胰島素效應(yīng)組織等參與胰島素穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[35]。在膜外刺激下，酪氨酸蛋白激酶激活，引起胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)磷酸化并催化質(zhì)膜上的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)磷酸化，活化Akt，活化的Akt從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)、線粒體和胞核內(nèi)，引起底物的磷酸化，信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生[35-38]。 PI3K/Akt 信號通路的激活可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，發(fā)揮抗凋亡作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以通過調(diào)節(jié) PI3K/Akt 信號通路，上調(diào)p-Akt、抑制p-GSK-3β的蛋白水平，進(jìn)而上調(diào) cyclin D1 表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化，從而促進(jìn)糖尿病足大鼠的新生血管形成。體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建重組腺病毒載體以提高神經(jīng)導(dǎo)向蛋白netrin-1表達(dá)量，netrin-1上調(diào)恢復(fù)了受損的PI3K/Akt-eNOS信號通路，并通過PI3K/Akt-eNOS信號通路改善HUVECs功能障礙[39]。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠糖尿病皮膚潰瘍模型中，用三七皂苷Ft1進(jìn)行處理后，F(xiàn)t1通過PI3K/Akt/mTOR信號通路促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。此外，體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞并用三七皂苷Ft1處理后發(fā)現(xiàn)Ft1通過PI3K/Akt/mTOR信號通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[40]。

3.3絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路在干細(xì)胞治療DCU中的作用 MAPK在細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化、發(fā)育、凋亡和惡化中扮演重要作用[41]。MAPK通路可分為4個(gè)傳導(dǎo)路線：ERK、p38 MAPK、JNK和ERK5，又通過MAPK、MAPK激酶(MAPK kinase，MEK或MKK)及MAPK激酶的激酶(MAPK kinase，MAPKKK)3種激酶的級聯(lián)反應(yīng)將胞外刺激傳遞到胞內(nèi)。有研究表明，MAPK信號的級聯(lián)反應(yīng)可能抑制IRS磷酸化，導(dǎo)致胰島素的抵抗。MAPK信號通路的激活抑制了GLUT4的表達(dá)，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少[42]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，高糖可使培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞p38 MAPK活性升高，并促進(jìn)下游基因表達(dá)[43]。p38 MAPK激活可使平滑肌增大，內(nèi)皮細(xì)胞紊亂，加速粥樣化的形成。張超等[44]在Wister大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯能改善糖尿病下肢缺血血運(yùn)重建過程，促進(jìn)血管新生，可能是通過促進(jìn)Akt表達(dá)，抑制p38 MAPK表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。Choi等[42]用石花菜提取物對C57BL/KsJ-db/db小鼠進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)其通過活化胰島素受體、PI3K和上調(diào)GLUT4來激活胰島素信號通路，與此同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)提取物處理組小鼠MAPK信號通路下調(diào)。有研究表明，體外培養(yǎng)HUVECs 并用血竭素處理后發(fā)現(xiàn)，血竭素主要通過 Ras/MAPK信號通路促進(jìn)HUVECs 增殖及遷移并提高其管生成能力[45]。

4 展望

目前臨床及臨床前的數(shù)據(jù)證明干細(xì)胞移植治療DCU是一種有效的方法，但仍然面臨許多挑戰(zhàn)：(1)干細(xì)胞的獲得和純度控制；(2)到底該使用哪一類干細(xì)胞為最優(yōu)來源；(3)哪一類臨床前的動(dòng)物模型與臨床差距最?。?4)缺乏相應(yīng)的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法；(5)如何確定干細(xì)胞的最佳移植濃度、移植方法和移植時(shí)間；(6)干細(xì)胞的長期生存能力和治療功效；(7)長期應(yīng)用是否會(huì)出現(xiàn)增殖難以控制而致瘤等。未來，微粒化的干細(xì)胞或選擇合適的移植物載體(如水凝膠、生物支架等)更有利于干細(xì)胞發(fā)揮治療作用；同時(shí)，由于不同DCU患者產(chǎn)生潰瘍的機(jī)制不盡相同，從機(jī)制針對性地進(jìn)行干細(xì)胞移植治療能更有效地治療DCU；盡管自體干細(xì)胞是最常用的干細(xì)胞類型，但未來的研究可能會(huì)探索多能干細(xì)胞以及同種異體甚至異種細(xì)胞的使用；再者，干細(xì)胞聯(lián)合其它療法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)膫€(gè)體化精準(zhǔn)治療，能更有效緩解及解除患者病痛。總之，如何找到合適的載體和移植途徑及基質(zhì)設(shè)計(jì)和配置對干細(xì)胞功能的影響，如何快速鑒別DCU患者潰瘍產(chǎn)生的具體機(jī)制，怎樣保證干細(xì)胞移植發(fā)揮最大作用，怎樣進(jìn)行聯(lián)合治療是未來干細(xì)胞治療DCU臨床及臨床前研究亟待解決的問題。