前列腺癌人源性異種移植模型的建立及治療藥物的篩選

陳薛，師長宏,2*

(1. 成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，成都　610500； 2. 第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，西安　710032)

前列腺癌作為男性泌尿生殖系統(tǒng)重要的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈顯著增長的趨勢。雖然近年來有關前列腺癌的研究逐步深入，但仍缺乏能夠準確概括疾病發(fā)生發(fā)展并高效轉化入臨床研究的動物模型。

目前已報道的前列腺癌動物模型主要有基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse，GEM)、細胞系異種移植模型(cell line derived xenograft， CDX)和人源性異種移植模型(patient-derived xenograft，PDX)，這些模型各具有各自的優(yōu)缺點和應用范圍。GEM是研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中單一或多個基因作用的有效模型[1]，包括小鼠前列腺轉基因腺癌模型(transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate，TRAMP)[2]以及pten和p53聯(lián)合缺失小鼠等[3]。此類模型成本高，且模型所表現(xiàn)出的雄激素依賴性可能與臨床無關或小鼠自身不存在前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)等問題，使其在藥物開發(fā)及評價的應用受限[4-5]。據(jù)現(xiàn)有文獻報道，PC3、LNCaP和DU145細胞系是用于建立前列腺癌CDX模型的常用細胞系，穩(wěn)定成瘤的僅有PC3細胞系，但這種模型不能重現(xiàn)臨床前列腺癌的多種異質性，不能代表癌細胞與其基質成分之間的相互作用，不夠充分預測臨床藥物治療反應及效果。在一項使用CDX模型檢測新型抗雄激素MDV-3100的研究中，藥物在LNCaP細胞系所建立的CDX模型中的反應率達到92%，但在臨床上，MDV-3100的反應率僅有不足50%[6]。近年來，人們嘗試將前列腺癌病人新鮮的瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內建立PDX模型較好的保持了原發(fā)瘤的組織形態(tài)特征。但由于大部分前列腺癌的發(fā)生與激素密切相關，造成原發(fā)性前列腺癌移植小鼠后成功率較低，阻礙了PDX模型的應用[7-9]。本文重點介紹了前列腺癌PDX模型建立方法的研究進展及其在個體化治療研究中的應用。

1　影響模型建立的因素

1.1　體內雄激素水平

雄激素的刺激與前列腺組織的生長密切相關，體內雄激素的水平很大程度上決定了建模的成敗，而雄激素以睪丸分泌的睪酮為主。正常男性血清睪酮水平范圍為14～25.4 nmol/L，但正常免疫缺陷小鼠血清睪酮水平均數(shù)明顯低于此值，且波動范圍較大，無法模擬正常男性血清睪酮水平。因此，建立前列腺癌PDX模型需要補充外源性雄激素[10-11]。另有研究表明，雄激素對前列腺細胞或組織的生長發(fā)育具有雙向作用[12-13]。汪涌等[14]在LNCaP細胞培養(yǎng)液中加入不同劑量的人工合成雄激素R1881，發(fā)現(xiàn)其在10-9mol/L及以上濃度時抑制LNCaP細胞生長，相反，在10-10mol/L及以下濃度刺激細胞生長。程尚等[13]通過在前列腺癌荷瘤小鼠皮下包埋不同劑量睪酮，也證實了高劑量(20 mg)及低劑量(5 mg)補充對前列腺癌的生長起不同作用。小鼠在去勢狀態(tài)下皮下包埋適當劑量的雄激素能模擬前列腺癌患者的血清睪酮水平，且成瘤率高達90%[13,15]。越來越多的研究者在建立前列腺癌PDX模型時為小鼠補充一定劑量的外源性雄激素，以促進前列腺癌細胞的生長發(fā)育和疾病進程，從而提高前列腺癌PDX模型的成功率[16-17]。

1.2　原始腫瘤組織的特征

成功建立前列腺癌PDX模型需要高質量的新鮮腫瘤組織[17]，并及時將其接種于小鼠體內，以確保腫瘤組織存活及其活力。腫瘤組織離體后處于缺血缺氧狀態(tài)，而這種缺血性損傷會對組織細胞的生長發(fā)育能力產(chǎn)生負面影響，進而影響腫瘤組織的移植成功率。Young等[18]在一項胃癌PDX模型的研究中發(fā)現(xiàn)減少腫瘤組織離體時間和總移植時間與移植成功率呈正相關(P=0.003和P=0.01)。也有人使用切片機將瘤組織切割成約300 μm厚度，以便氧氣及營養(yǎng)物質最大限度地擴散到PDX中[19]。精確修剪用于移植的前列腺癌組織，去除電刀灼傷等機械損傷部位的同時，應注意保留移植組織中惡性病灶[20-21]，腫瘤癌細胞數(shù)量大于50%且細胞Ki67表達陽性也可以提高前列腺癌PDX模型的成功率[17]。另外瘤組織中TMPRSS2-ERG融合基因、腫瘤分期以及前列腺特異性抗原(PSA)、雄激素受體(androgen receptor，AR)水平等均是影響PDX模型成功的因素。TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌中發(fā)生率很高，幾乎一半的患者中都存在這種基因融合，是發(fā)生最為頻繁的基因變異，TMPRSS2-ERG融合基因的發(fā)生與ERG蛋白的表達有關[22-25]， ERG蛋白表達率高則前列腺癌多為低分化期，其惡性程度高[26-28]，移植裸鼠PDX模型成功率較高。也有研究認為，血清PSA水平短期內快速上升，提示疾病處于進展期，腫瘤組織惡性程度較高[17]；而AR表達與前列腺癌病理分期呈負相關[29-30]，其在雄激素依賴型前列腺癌向去勢抵抗性發(fā)展的過程中起關鍵作用，特別是AR剪接變體—AR-V7可以作為晚期前列腺癌潛在的預測性腫瘤標志物[31]，因此，腫瘤組織中PSA、AR陽性率對移植成功率有一定的影響。綜上所述，使用晚期或進展期前列腺癌患者的標本，去除物理損傷，選用高質量的腫瘤組織及時接種至免疫缺陷小鼠可以提高PDX模型的成功率。

1.3　腫瘤基質環(huán)境和間質重組

人前列腺腫瘤組織移植到在小鼠體內生長需要數(shù)月不等，生長緩慢且通常成活率極低。這是多因素相互作用的結果，特別是基質微環(huán)境，包括免疫細胞、成纖維細胞、細胞外基質和脈管系統(tǒng)等在前列腺腫瘤發(fā)生中的缺失。因此，為了重現(xiàn)基質微環(huán)境的作用，許多實驗室將人前列腺癌組織與新生鼠精囊間質混合，然后共移植入小鼠體內。結果顯示，采用這種方法為移植物提供了一個較為理想的微環(huán)境生態(tài)位，前列腺癌組織生長活躍，獲得了良好的成瘤效果，且維持了人類腫瘤組織的重要特性[32-35]。另外，也有人將瘤組織中混入基質膠(Matrigel)或層粘連蛋白，也獲得了較高的成功率[36]，相似的結果在其他類型腫瘤PDX模型中也有報道[37-38]。

1.4　其他因素

已證實移植所用小鼠的免疫缺陷越高，則移植成功率會有相應提升[39-42]。早期前列腺癌PDX研究常使用雄性裸鼠，其成瘤率較低；隨后，人們使用免疫缺陷程度更高的SCID小鼠，或者是NOG小鼠和B-NDG小鼠[42-43]。此外，關于前列腺癌組織移植位點，皮下移植成功率較低，通常不足10%[15, 44]；腎包膜下血管化豐富，具有良好的組織液壓力和淋巴流量，利于前列腺癌組織的生長，建模成功率最高可達93.4%[19,45-47]。影響前列腺癌PDX模型成功率的許多因素尚未明確，如何提高成瘤率亟待解決。因此，進一步驗證并深入了解這些影響因素將有利于我們探索前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，從而改善臨床患者的治療效果。

2　PDX模型的評估和應用

PDX模型是否成功建立，首先是保證移植瘤組織存活，且凍存之后能夠再次在小鼠體內復蘇并穩(wěn)定傳代。必須對傳代的移植瘤進行多項檢測，確認是否能夠重現(xiàn)前列腺癌疾病的多樣性，從而確認與人類原發(fā)腫瘤的一致性。

2.1　一致性分析

通過H&E染色比較原發(fā)瘤與移植瘤之間組織形態(tài)學差異是檢測前列腺癌PDX模型溯源性的重要方法。前列腺癌病理類型中腺癌最為常見(>95%)，其組織結構通常表現(xiàn)為異形核、結構異常以及局部浸潤，例如正常腺泡結構變形或消失，出現(xiàn)單層上皮細胞、藍色粘蛋白、篩狀結構或實性巢狀/條索狀結構等[48]。同時需對原發(fā)瘤和移植瘤進行免疫組織化學染色，利用抗原抗體反應，檢測相關抗原的分布和表達情況，確保其一致性。前列腺癌組織中最常檢測的抗原有PSA、p63、34βE12、CK5/14/18、AMACR、P504S等。PSA在大多數(shù)前列腺癌中都會有所升高，它常作為衡量患者病情進展與患者生存期的預測因子，與Gleason分級、腫瘤分期一起決定患者的臨床治療方案[49-51]。因此，PSA常作為評價前列腺癌PDX模型保真度的檢驗指標之一。最近，研究人員對其所建立的異種移植物進行分析，結果表明這些模型重現(xiàn)了臨床前列腺癌患者中常見的疾病變異性和異質性，包括前列腺癌激素依賴型向非依賴型的轉分化以及人類疾病表型中最常見的基因組改變：TMPRSS2-ERG重排和AR擴增等；也有一些異種移植物在AR配體結構域中表現(xiàn)出了mCRPC中常見的AR突變[52-53]。大量的分析結果顯示PDX模型可以保留原發(fā)瘤的主要特征，特別是有一部分PDX模型能夠基本模擬人類前列腺癌進程。此外，研究發(fā)現(xiàn)p63、AMACR、P504S等一系列前列腺癌標記物，都能夠與PSA檢驗相結合，將良惡性前列腺組織區(qū)分開來，成為驗證PDX模型與相應患者腫瘤組織一致性的標準[54]。另外，檢測血清游離PSA和總PSA并計算二者比值，能夠提高前列腺腫瘤篩查和診斷的特異性。

工信部原材料司處長張文明表示：“我們國家在繼續(xù)實施扶持國產(chǎn)鉀肥發(fā)展的優(yōu)惠政策，保障國產(chǎn)鉀肥競爭力和提升自給率的同時也要加快境外鉀肥基地建設，實現(xiàn)雙輪驅動，鞏固國內價格洼地，從國家層面頂層設計，引導企業(yè)有序推進‘走出去’步伐。對境外鉀肥基地加大支持力度，形成雙翼協(xié)同保障我國鉀肥的穩(wěn)定供應，提升我國在國際鉀肥市場的話語權?！庇捎诟鞣矫鏃l件限制，建設一個大型鉀鹽生產(chǎn)企業(yè)從勘探、設計、建設到出成品至少需要5-7年的時間，建設周期漫長且投資巨大。據(jù)了解，目前我國在境外已進入生產(chǎn)運營階段的企業(yè)只有在老撾的中農(nóng)集團和開元集團，它們是我國“走出去”找鉀和采鉀的企業(yè)佼佼者。

2.2　治療藥物的篩選

治療前列腺癌的藥物主要分為激素類藥物和化學藥物。在PDX模型上進行療效觀察，能夠為個體臨床患者治療提供重要參考。

2.2.1激素類藥物

前列腺癌的發(fā)病與雄激素有關，激素類藥物治療是晚期雄激素依賴型前列腺癌最重要的治療手段。其中，比卡魯胺具有較好的臨床效益，是臨床治療前列腺腫瘤最常用的激素類藥物之一[55-57]。且在前列腺癌PDX模型的藥物研究中，比卡魯胺同樣顯示了延緩體內腫瘤生長，延長荷瘤小鼠存活期的效果，并可以有效降低血清PSA水平[58-59]。另外一種較為常用的藥物——地蓋瑞利，可在用藥后快速降低雄激素水平，無睪酮一過性升高現(xiàn)象，且可降低PSA進展的風險。Charlotte等[59]建立了激素依賴性的前列腺癌PDX模型PAC120，使用地蓋瑞利和其他三種藥物單獨或聯(lián)合處理，結果顯示，地蓋瑞利與曲妥珠單抗聯(lián)合治療能夠有效抑制腫瘤生長，并且?guī)缀跬耆苊饬思に靥右莠F(xiàn)象的發(fā)生，而單獨的曲妥珠單抗治療并沒有效果。

2.2.2常規(guī)化療藥物

這些校企合作的實驗室和實習基地的建立，為學生營造了科學實踐的環(huán)境，擴大了實踐的機會，拓展了計算機網(wǎng)絡實踐的技術領域，推動了產(chǎn)學合作教育向縱深方向的發(fā)展。

21世紀以前，尚無研究證實化學療法能改善前列腺癌患者的生存，其在前列腺癌治療中主要以改善癥狀為主。直到2004年Tannock 等[60]使用多西他賽聯(lián)合潑尼松治療晚期前列腺癌，結果顯示多西他賽能有效延長進展期去勢抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)患者生存期，緩解癥狀。這重新燃起了化學藥物治療前列腺癌的希望，研究者們陸續(xù)發(fā)起了多個多西他賽治療前列腺癌的研究。2006年，Yao等[61]研究發(fā)現(xiàn)與單獨多西他賽或去勢治療組的荷瘤小鼠相比，多西他賽治療后去勢組，表現(xiàn)出最有效的抗腫瘤作用。且經(jīng)TUNEL測定證實，該組凋亡腫瘤細胞密度明顯高于其他治療組。2008年，Yin 等[62]聯(lián)合多西他賽與單克隆抗磷脂酰絲氨酸(PS)抗體2aG4(一種血管靶向單克隆抗體)治療小鼠激素難治性前列腺癌起到了明顯的腫瘤抑制作用。其后續(xù)實驗表明，2aG4增強了多西他賽抗腫瘤生長和抗轉移活性的作用，且二者聯(lián)合治療的毒副作用較小。2014年，Qu等[63]將多西他賽與具有體外抗前列腺癌活性的多價植物藥物Aneustat(OMN54)結合來改善晚期前列腺癌的療效，數(shù)據(jù)顯示二者之間有顯著的協(xié)同作用，該組合增強了抗腫瘤活性，且未引起明顯的毒性反應。

3　展望

建立高保真的前列腺癌PDX模型是前列腺癌生物學研究和藥物治療的基礎。理想的前列腺癌PDX模型不僅應能夠維持原發(fā)腫瘤中的組織結構、異質性和基質組分，其疾病的進展過程及對藥物的反應性也應與臨床結果高度相似。但前列腺癌PDX模型的成功率極低，限制了其發(fā)展及應用，如何提高成模率成為建立這種模型的關鍵。為此，科學家們進行了多種嘗試，包括補充外源性雄激素、新鮮腫瘤組織與新生鼠精囊間質重組以及“human-in-mouse”模型等[7, 64-65]；為了更精準地模擬人類前列腺癌特性，也有人將人造血干細胞或外周血單核細胞注射于小鼠開發(fā)了“human-in-mouse”模型，以在小鼠體內重現(xiàn)人類部分免疫成分，提供前列腺癌生長所需的免疫微環(huán)境[66-67]。這在一定程度上解決了小鼠免疫缺陷而無法用于評估抗腫瘤免疫治療的問題。上述嘗試對前列腺癌新藥研發(fā)和作用機制研究具有重要意義，進一步推進了前列腺癌個體化腫瘤治療的進程，并促進其研究結果向臨床轉化。