2型糖尿病患者調(diào)節(jié)性T細胞的抑制功能

王 芬 朱紅霞 高玉斌

(武漢市中心醫(yī)院新洲院區(qū)內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430400)

眾所周知，免疫因素在2型糖尿病(T2DM)發(fā)病過程中起到重要作用，T2DM患者常存在自身免疫系統(tǒng)的紊亂〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者體內(nèi)，自身反應(yīng)性T細胞可與胰島素發(fā)生免疫反應(yīng)，從而損害胰島組織，促進病情發(fā)展〔2，3〕。外周組織中具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)可以調(diào)控自身反應(yīng)性T細胞的功能，防止其對自身組織器官，如胰島組織產(chǎn)生損害。因此，Treg細胞在T2DM發(fā)病過程中起到重要作用，其功能受損與T2DM的發(fā)病密切相關(guān)〔4～6〕。動物實驗證實，小鼠體內(nèi)Treg細胞可以調(diào)控T細胞對胰島細胞的自身反應(yīng)性〔7～10〕。本研究旨在探討T2DM患者和正常人外周血中Treg細胞的比例與功能的變化。

1 對象與方法

1.1對象 選擇2016年2～9月在新洲醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的60例T2DM患者為研究對象，歸為2型糖尿病組(T2DM組)，男35例，女25例，年齡42～76歲，平均(57.4±12.8)歲。另選擇同期在院體檢的20例健康人作為對照組，男11例，女9例，年齡40～75歲，平均(55.1±11.9)歲。所有研究對象研究前均未接受放射性治療，化療或其他的治療。所有研究對象對本次研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2儀器與試劑 細胞培養(yǎng)基(含RPMI、10%FBS、55 mmol/L 2-mercaptoethanol、2 mmol/L L-glutamine、10 μg/ml gentamicin、10 μmol/L HEPES)。流式分析儀器購自BD公司。流式熒光抗體購自Ebioscience公司。

1.3方法

1.3.1提取外周血單個核細胞 取研究對象25 ml外周靜脈血，采用Ficoll-Paque (Sigma，CA，USA)梯度離心。

1.3.2細胞分選 采用CD4+CD25+Foxp3+CD127-磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)分選調(diào)節(jié)性T細胞，采用CD4+CD25-磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)分選CD4+CD25-T細胞。流式細胞術(shù)檢測純度均在95%以上。

1.3.3流式細胞術(shù)分析樣品的制備 將細胞重懸在200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細胞標(biāo)2 μl流式抗體。置4℃冰箱中避光孵育20 min，用1 ml PBS洗一次。先標(biāo)表面分子，再核固定標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。取300 μl PBS上流式儀器分析。

1.3.4體外抑制實驗 將CFSE標(biāo)記(終濃度2 μmol/L)的CD4+CD25-T細胞與Treg細胞共培養(yǎng)5 d，共培養(yǎng)比例為1∶1或者1∶0，分析CD4+CD25-T細胞的增殖情況。抑制率計算公式：抑制率(%)=〔1-(有Treg共培養(yǎng)的增殖率/沒有Treg共培養(yǎng)的增殖率)〕×100%。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用Graph Pad Prism5.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血Treg細胞在淋巴細胞與CD4+T細胞中的比例 將表達CD4+CD25+Foxp3+CD127-定義為Treg細胞。T2DM組〔(0.62±0.09)%〕與對照組〔(0.65±0.10)%〕中Treg細胞在淋巴細胞中的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。T2DM組〔(1.76±0.23)%〕與對照組〔(1.81±0.27)%〕中Treg細胞在CD4+T細胞中的比例差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組外周血Treg細胞中Foxp3表達強度比較 Treg細胞主要特征是表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，F(xiàn)oxp3的表達與Treg細胞的抑制性功能密切相關(guān)。與對照組相比，T2DM患者Treg細胞中Foxp3的表達強度(MFI)明顯降低〔(21.05±2.2)vs(32.43±3.12)，P=0.023〕。

2.3兩組外周血Treg細胞抑制能力比較 體外抑制實驗顯示，T2DM患者外周血Treg細胞抑制能力明顯低于對照組〔(31.17±3.78)% vs (58.62±4.98)%，P=0.019〕。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，患者外周血Treg細胞比例沒有顯著變化，這說明T2DM患者外周血中所含的Treg細胞的比例沒有發(fā)生異常，調(diào)節(jié)性T細胞與效應(yīng)T細胞平衡的改變，不是導(dǎo)致T2DM患者免疫抑制能力缺陷的原因。雖然Treg細胞比例沒有發(fā)生顯著變化，但是其表達的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達的MFI顯著降低；同時，Treg細胞的抑制功能也顯著減弱。在研究結(jié)果中，來源于健康人的外周血Treg細胞可以有效地抑制CD4+CD25-T細胞的增殖。相反，來源于T2DM患者的調(diào)節(jié)性T細胞無法有效地抑制自體對CD4+CD25-T細胞的增殖。

近年的研究表明，Treg細胞失能與Foxp3的表達降低或者異常有關(guān)〔11～14〕。本研究結(jié)果與之前的研究相一致，發(fā)現(xiàn)T2DM患者的免疫抑制功能缺失，很大程度上是由于Treg細胞的失能，很可能是由于這些調(diào)節(jié)性T細胞表達的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3不穩(wěn)定，正如本研究觀察到的Foxp3表達MFI降低，使Treg細胞轉(zhuǎn)變?yōu)門H1，TH2，TH17等效應(yīng)細胞。目前關(guān)于Treg細胞失能與T2DM患者之間直接聯(lián)系還有待深入研究。但是，Treg細胞的受損解釋了為什么T2DM患者對自身抗原耐受的紊亂導(dǎo)致了患者更易發(fā)生自身免疫性疾病。關(guān)于T2DM患者Treg細胞失能的具體機制，還需要進一步探究。

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