血清4型禽腺病毒研究進(jìn)展

朱慶賀，張鵬宇，王觀悅，王 爽，陳 曦，楊旭東，史同瑞?

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161000；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶163000）

4型禽腺病毒（Fowl avianadenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）主要是以心包積水為主要臨床癥狀的雞急性傳染病，臨床中又稱(chēng)為“雞心包積水綜合征（Hydropericardium syndrome，HPS）”。 該病發(fā)病急，傳播速度快，主要引起4～8周齡肉雞感染，死亡率可達(dá)40%～90%。該病最早于巴基斯坦的安卡拉被報(bào)道，由此又成為“安卡拉病”。近年來(lái)，我國(guó)河南、山東、安徽、遼寧、吉林、江西和湖北等省份出現(xiàn)大面積爆發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文綜述了目前FAdV-4的相關(guān)研究進(jìn)展，希望能為FAdV-4的進(jìn)一步研究以及臨床防控提供參考。

1 病毒分類(lèi)、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

腺病毒科（Adenoviridae）因最初從腺體組織分離，故名腺病毒，而根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)特性和宿主范圍可劃分為兩個(gè)屬：哺乳動(dòng)物腺病毒屬（Mastadenivirus）和禽腺病毒屬（Avianadenovirus）。禽腺病毒屬根據(jù)其抗原性的不同可分為3個(gè)群。FAdV-4隸屬于腺病毒科禽腺病毒屬Ⅰ亞群，亞群已鑒定了5個(gè)禽腺病毒種，其名稱(chēng)用字母A～E表示，根據(jù)其血清型測(cè)試分為12個(gè)血清型。FAdV-4屬于禽腺病毒C種血清4型。病毒粒子無(wú)囊膜，直徑70～90 nm，呈 20面體對(duì)稱(chēng)，由衣殼（Capsid）、纖突（Fibre）、核酸芯髓（Core）及相關(guān)蛋白構(gòu)成。其衣殼由252個(gè)殼粒（Capsomere）組成，其中20面體頂角上為12個(gè)五鄰體（Penton），每個(gè)五鄰體有兩條纖突，長(zhǎng)100A-370A，直徑2 nm，纖突由五鄰體蛋白為基底在衣殼表面伸出，纖突頂端形成頭節(jié)區(qū)（Knob）。頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合。其余240個(gè)非頂角殼粒為六鄰體蛋白（Hexon）構(gòu)成20面體的面和棱的大部分，六鄰體成棱柱狀，直徑7～11 nm。病毒粒子在感染細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)常呈晶格狀排列。病毒核酸為雙股DNA，占據(jù)整個(gè)病毒的11.3%～13.5%［1］。 病毒對(duì)脂溶劑，如乙醚、氯仿、脫氧膽酸鈉、胰蛋白酶、2%酚以及50%乙醇等具有抵抗力，同時(shí)可耐受pH3-9，但在濃度1∶1000的甲醛中可被滅活。另外，病毒的增殖也可被DNA抑制劑 BuDR 所抑制［2］。

2 流行病學(xué)

FAdV-4感染主要以雞包涵體肝炎和心包內(nèi)出現(xiàn)淡黃色透明液體為主要臨床癥狀，因此也被稱(chēng)為HPS。HPS最早在巴基斯坦靠近卡拉奇的安卡拉首先被報(bào)道［3］。其后，在土耳其、斯洛伐克、印度、墨西哥、秘魯、俄羅斯、孟加拉國(guó)、韓國(guó)相繼出現(xiàn)該?。?］。 2006 年第一次在中國(guó)被報(bào)道［5］， 但 直 到2015年7月開(kāi)始在中國(guó)的河南、河北、遼寧、吉林、黑龍江、新疆、安徽、山東、江西、湖北和江蘇等省份迅速傳播［6-7］。該病主要發(fā)生在炎熱、濕潤(rùn)的夏季，但其他季節(jié)也可零星發(fā)生，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)40%～90%。疾病主要4～8周黃羽肉雞中爆發(fā)，2～3周齡偶發(fā)，通常經(jīng)過(guò)一個(gè)24～48 h的潛伏期。特征性癥狀為心包出現(xiàn)淡黃色透明液體，肝臟腫脹，腎臟水腫，尿酸鹽沉積。通過(guò)擴(kuò)增中國(guó)分離的12株FAdV-4 Hexon基因并遺傳進(jìn)化樹(shù)分析序列顯示這些毒株可能來(lái)源于之前的印度株［8-9］。

測(cè)序結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-4中國(guó)株與澳大利亞、墨西哥、加拿大的 KR5、ON1、MX-SH90對(duì)比分析顯示存在ORF19基因缺失。已有研究證明，ORF19基因缺失毒株比ORF19完整毒株具有更高的致病性，ORF19基因的缺失也被認(rèn)為是FAdV-4在中國(guó)造成大量流行的主要原因［10］。另外，還發(fā)現(xiàn)這些2015年分離的FAdV-4中國(guó)株與2013年分離的中國(guó)株的ORF29基因出現(xiàn)了33 nt和6 nt的基因缺失，可能暗示近年來(lái)爆發(fā)的FAdV-4株適應(yīng)了中國(guó)的宿主和環(huán)境［11］。

最近報(bào)道稱(chēng)，在麻鴨中發(fā)現(xiàn)了FAdV-4發(fā)生，病毒感染25日齡麻鴨，病鴨呈現(xiàn)出與心包積液病雞相似的臨床癥狀，死亡率達(dá)40%［12］。然而，雛鴨并未出現(xiàn)死亡情況。另外，鴕鳥(niǎo)中也有Ⅰ群禽腺病毒分離的報(bào)道，利用12種標(biāo)準(zhǔn)毒陽(yáng)性血清鑒定，確定分離株為FAdV-4，血清鑒定結(jié)果也與基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析相符合［13］。利用基因序列分析進(jìn)行流行病學(xué)數(shù)據(jù)調(diào)查對(duì)于闡述FAdV-4在不同宿主之間進(jìn)化關(guān)系，以及FAdV-4的預(yù)防和控制具有重要意義。

3 發(fā)病特征

已有研究證明，純化的FAdV-4毒株攻毒SPF雛雞24～48 h后可引起死亡，病雞表現(xiàn)精神沉郁，閉目嗜睡，出現(xiàn)臨床癥狀24 h內(nèi)死亡，剖檢可見(jiàn)明顯的心包積液癥狀。不同的肉雞毒株在田間呈現(xiàn)相似的敏感性。雞胚卵黃囊接種FAdV-4出現(xiàn)雞胚發(fā)育遲緩，出血，最終以胚胎死亡而告終。研究人員通過(guò)皮下注射，口服的方式均能復(fù)制出HPS［14］，F(xiàn)AdV-4對(duì)肉雞表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病性，在臨床中能夠橫向通過(guò)糞便途徑在雞群甚至農(nóng)場(chǎng)間傳播。在產(chǎn)蛋母雞被感染后，其后代可能出現(xiàn)先天性感染，進(jìn)一步促進(jìn)了病原的廣泛傳播。

野生鳥(niǎo)類(lèi)FAdV-4抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，烏鴉和鴿子的血清樣本的陽(yáng)性率較高，這表明野生鳥(niǎo)類(lèi)可能是病原的攜帶者［15］，在自然條件下可能成為疾病傳播的特定宿主。另外，有研究表明，F(xiàn)AdV-4毒株對(duì)淋巴組織有偏好，能夠?qū)е翨、T細(xì)胞的耗竭，從而導(dǎo)致免疫抑制［16］。而HPS發(fā)生時(shí)常常伴發(fā)其他病毒如傳染性法氏囊（IBD）及雞傳染性貧血病毒（CIA）的感染，這可能與其免疫抑制有關(guān)［17］。

4 診斷方法

4.1 臨床及病理診斷 臨床中4～8周齡的肉雞死亡率較高。對(duì)瀕死雞分析表明，受感染病雞精神沉郁，24 h內(nèi)突然死亡，外觀沒(méi)有明顯的臨床癥狀，剖檢可見(jiàn)心包內(nèi)出現(xiàn)一種淡黃色透明液體，肝臟腫脹，偶爾可見(jiàn)腎炎癥狀。病理組織切片分析顯示，攻毒試驗(yàn)雞出現(xiàn)心肌淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟中肝細(xì)胞壞死及出現(xiàn)嗜堿性核內(nèi)包涵體，其中嗜堿性核內(nèi)包涵體可作為FAdV-4感染的典型特征［18］。

4.2 病毒分離 病雞肝臟是主要的感染相關(guān)器官，病毒載量最高。因此，F(xiàn)AdV-4可以通過(guò)受感染的肝臟組織懸液接種雞胚尿囊腔或卵黃囊的方式進(jìn)行分離和純化，也能在雞胚胎腎細(xì)胞、雞胚胎肝細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞以及鵪鶉成纖維細(xì)胞（QT-35）上分離［19］，細(xì)胞感染后呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞脫落，感染細(xì)胞內(nèi)存在包涵體。經(jīng)純化的病毒在透射電鏡下與肝臟組織切片具有相同的形態(tài)學(xué)特征。

4.3 電鏡 利用電鏡可以對(duì)病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)檢查，在微生物的診斷中起著至關(guān)重要的作用，從受感染動(dòng)物的血液、體液或組織中觀察到病毒粒子存在是確診病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)HPS病例中肝臟勻漿、肝細(xì)胞或病毒顆粒進(jìn)行染色，利用透射電鏡可以觀察純化后的腺病毒粒子，說(shuō)明FAdV-4是HPS的致病病原［20］。在受感染的肝細(xì)胞核中觀察病毒顆粒直徑約75 nm，無(wú)囊膜、六邊形、二十面體等典型特征，有助于對(duì)該病進(jìn)行確診。

4.4 分子生物學(xué)技術(shù) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的檢測(cè)方式。如限制性?xún)?nèi)切酶分析（REA）、DNA探針原位雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR［21］和高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM），均可用于FAdV-4的檢測(cè)和鑒別。

酶切分析（REA）REA最初用于對(duì)FAdV不同毒株進(jìn)行分組和鑒別。根據(jù)DNA的基因組相似性通過(guò)BamHⅠ和HindⅢ消化后，可從17株FAdV中得到11種血清型［22］。雖然FADV-4型和10型之間存在交叉中和，但利用 HindⅢ、DraⅠ、XbaⅠ、NotⅠ、SfiⅠ、BglⅡ、SmaⅠ和NaeⅠ酶切分析能夠揭示其中的差異［23］。PCR方法是檢測(cè)FAdV-4的最常用的方法。禽腺病毒PCR檢測(cè)的主要優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高。Hexon基因常被研究人員用來(lái)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)測(cè)序分析可將病毒的A～E種區(qū)分開(kāi)來(lái)，并定位到種內(nèi)特定的血清型［24］，通過(guò)PCR結(jié)合REA的方法可以檢測(cè)和分化12株FAdV的參考菌株［25］。此外，F(xiàn)iber基因因?yàn)槠渚幋a特定類(lèi)型的亞基因中和表位也被用于禽腺病毒的檢測(cè)。應(yīng)用Alu I.氏酶能夠建立針對(duì)Fiber基因的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）方法，可用于鑒別出現(xiàn)心包積液癥狀與不出現(xiàn)心包積液癥狀的 FAdV-4 毒株［26］。

利用熒光定量PCR方法可以達(dá)到檢測(cè)和量化FAdV-4的目的。以Hexon基因L1區(qū)設(shè)計(jì)引物，可建立一種HRM-curve檢測(cè)方法，用于FAdV-4的基因檢測(cè)和血清分型［27］。

4.5 血清技術(shù) 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)作為一種經(jīng)典血清學(xué)檢測(cè)方法，也被用于檢測(cè)FAdV-4，該方法操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)要求較低，適于較為簡(jiǎn)單的臨床及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

FAdV-4不具備使雞、大鼠以及小鼠紅細(xì)胞凝集的能力，但Manzoor S利用人O型紅細(xì)胞血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)了野生鳥(niǎo)類(lèi)中FAdV-4血清抗體情況［15］，得到了很好的試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)然，最準(zhǔn)確的診斷手段依然是病毒的中和試驗(yàn)（VN），但試驗(yàn)要求較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且價(jià)格比較昂貴。

ELISA檢測(cè)是FAdV-4血清學(xué)診斷的重要方法，早期研究中應(yīng)用全病毒包被抗原檢測(cè)自然感染和試驗(yàn)感染的雞血清樣本中FAdV的抗體。但是病毒抗原的制備相對(duì)繁瑣且效率低下，敏感性和特異性較低。后期研究人員利用Hexon蛋白具備抗原決定簇的特點(diǎn)，利用FAdV-4的Hexon蛋白包被抗原，建立了FAdV-4的抗體檢測(cè)方法，但由于Hexon蛋白是群禽腺病毒的群特異性抗原，可能影響血清型特異性的鑒別［28］。因此，研究人員利用FAdV-4的Fibre蛋白進(jìn)行表達(dá)并作為包被抗原，能夠做到針對(duì)4型禽腺病毒檢測(cè)的目的［29］，另外，非結(jié)構(gòu)蛋白100K、33K等也都有成功表達(dá)并做為包被抗原建立ELISA檢測(cè)方法的報(bào)道［30］。基于重組蛋白包被建立的間接ELISA被證明是敏感、特異和準(zhǔn)確的，但更重要的是，這些方法更容易標(biāo)準(zhǔn)化，因此適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。

5 預(yù)防策略

做好養(yǎng)殖場(chǎng)所以及養(yǎng)雞設(shè)備的消毒工作，適當(dāng)?shù)臏囟取穸?、通風(fēng)處理，均能影響雞心包積水的發(fā)病情況，但由于引發(fā)雞HPS的主要病原FAdV-4存在，所以最行之有效的控制該病的發(fā)生仍然是疫苗的預(yù)防。目前，已報(bào)道的用于預(yù)防FAdV-4的疫苗主要分為滅活苗、弱毒苗以及基因亞單位疫苗三類(lèi)。

5.1 滅活疫苗 Afzal等［31］利用感染 HPS 病雞的肝臟組織制備滅活疫苗，田間試驗(yàn)結(jié)果表明，接種疫苗組死亡率為0.52%，而未接種疫苗的禽類(lèi)死亡率為5.34%。另外，在疾病爆發(fā)時(shí)緊急接種滅活疫苗結(jié)果顯示，未接種疫苗組死亡率達(dá)到了10.27%，接種疫苗組后死亡率僅為2.33%。韋悠等［32］利用FAdV-4和FAdV-8制備了禽腺病毒的雙價(jià)油乳劑滅活苗，免疫保護(hù)期可達(dá)6個(gè)月以上。

Kim M S等［33］通過(guò)對(duì)不同 FAdV-4毒株相關(guān)免疫原性等方面進(jìn)行鑒定，篩選了適合制備全病毒滅活疫苗的優(yōu)勢(shì)毒株，并研制了FAdV-4油乳劑滅活苗。通過(guò)免疫攻毒試驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)AdV-4油乳劑滅活苗能夠產(chǎn)生對(duì)血清4型，8a型以及11型的多血清型交叉保護(hù)。Pan Q等［34］針對(duì)在中國(guó)爆發(fā)的FAdV-4型毒株，分離制備了滅活疫苗，疫苗免疫后能夠產(chǎn)生高水平的抗體，其中，Th2（白細(xì)胞介素-4）免疫應(yīng)答優(yōu)于Th1（γ干擾素）。

5.2 弱毒疫苗 Mansoor M K等［35］利用雞胚連續(xù)傳代12次后致弱一株FAdV-4毒株，并與商品化的組織滅活苗共同免疫14日齡無(wú)母源抗體的肉雞，24日齡時(shí)應(yīng)用10倍劑量ELD50進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，弱毒疫苗比商品化滅活苗保護(hù)率更高，肝臟、心臟等組織器官傷害性更小，也證明了該弱毒疫苗具備免疫原性，有制備商品化弱毒苗的潛質(zhì)。

2004年，一株沒(méi)有HPS臨床癥狀的FAdV-4毒株被分離出來(lái)，命名為FAdV-4 ON1，SPF雞經(jīng)口服和肌肉內(nèi)感染接種FADV-4 ON1后，都能產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗FADV-4特異性抗體反應(yīng)。同時(shí)，禽類(lèi)抗感染細(xì)胞因子如干擾素（IFN）和白細(xì)胞介素（IL）-10在肝臟中的表達(dá)量也明顯增加［36］。

目前，滅活疫苗的接種是防治HPS較為有效的方式，具備制備簡(jiǎn)單、免疫效果確實(shí)的優(yōu)點(diǎn)，但是同時(shí)也存在刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體時(shí)間短，需重復(fù)免疫的缺點(diǎn)。弱毒疫苗維持免疫時(shí)間長(zhǎng)，但可能存在弱毒毒力返強(qiáng)，遺傳不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員試圖開(kāi)發(fā)一種亞單位疫苗，即利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FAdV-4的Penton蛋白，肉雞的免疫原性及攻毒保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)原核表達(dá)的Penton蛋白能夠提供90%的保護(hù)力［37］。

6 結(jié) 語(yǔ)

FAdV-4對(duì)肉雞有很高的致病性，目前已經(jīng)擴(kuò)散至亞洲、中美洲、南美洲以及一些歐洲國(guó)家，鑒于其擴(kuò)散迅速，F(xiàn)AdV-4對(duì)肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大損失，受影響的各個(gè)國(guó)家和地區(qū)應(yīng)制定預(yù)防方案，避免更嚴(yán)重的損失。

增強(qiáng)雞對(duì)FAdV-4的感染抵抗力是控制HPS發(fā)生的關(guān)鍵。一方面，環(huán)境因素起著至關(guān)重要的作用，控制好飼養(yǎng)環(huán)境溫度、濕度以及通風(fēng)情況能夠有效地控制心包積液癥狀的發(fā)生，另外做好雞舍環(huán)境的整體消毒工作，能夠減少FAdV-4在環(huán)境中的數(shù)量，抑制疾病的爆發(fā)。另一方面，疫苗接種仍是控制該病爆發(fā)的最有效方式，目前，研究人員正致力于滅活疫苗、弱毒疫苗以及亞單位疫苗的研究，并取得了一定的研究進(jìn)展，更有研究人員指出，可以嘗試?yán)脺p弱沙門(mén)氏菌菌株為載體制備口服疫苗，口服疫苗對(duì)于雞群免疫具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，雞群免疫通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，如果口服疫苗能夠研制成功，相信一定具備廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)。

除了針對(duì)FAdV-4的應(yīng)用研究外，對(duì)于FAdV-4的基礎(chǔ)研究也不應(yīng)忽視，ORF19基因缺失導(dǎo)致致病性增高還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。新分離FAdV-4中國(guó)株ORF29出現(xiàn)了33nt和6nt的基因缺失，是否為適應(yīng)中國(guó)宿主與環(huán)境的表現(xiàn)也需要繼續(xù)探索。