遺傳性聾基因診斷策略進(jìn)展*

劉亞蘭 桑樹山 劉學(xué)忠,2

聽力損失可以由多種因素引起，其中遺傳因素占語前感音神經(jīng)性聾的60%左右[1]。根據(jù)是否伴有其他器官或系統(tǒng)癥狀，遺傳性聾分為非綜合征型聾(non-syndromic hearing loss, NSHL)和綜合征型聾(syndromic hearing loss, SHL)。在語前聾中，大約70%為NSHL，30%為SHL。按照遺傳模式區(qū)分，大約80%NSHL為常染色體隱性耳聾(autosomal recessive deafness, DFNB)，20%為常染色體顯性耳聾(autosomal dominant deafness, DFNA)，1%為伴性染色體遺傳性聾,不足1%為線粒體相關(guān)性聾[2]。SHL的臨床表現(xiàn)除耳聾外，常伴有其他器官或系統(tǒng)的癥狀或體征，目前已發(fā)現(xiàn)400多種伴有耳聾的綜合征[3]。SHL伴隨的癥狀或體征可以幫助綜合征型聾的診斷，但是，這些伴隨癥狀可能出現(xiàn)在耳聾之后或者不被發(fā)現(xiàn)，從而影響SHL的正確診斷。

遺傳性聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，相同的臨床表現(xiàn)可由不同的基因突變或者同一基因的不同位點(diǎn)突變引起[2];一些基因可同時(shí)引起DFNA和DFNB，例如：GJB2、GJB6、MYO7A、COL11A2等；一些基因可同時(shí)引起NSHL和SHL，例如：GJB2、SLC26A4、MYO7A、CDH23等[4, 5]。同時(shí)，耳聾也具有表型異質(zhì)性，其表型與耳聾嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡、疾病進(jìn)展、累及單側(cè)或雙側(cè)、與已知的臨床綜合征的關(guān)聯(lián)性、聽力測試結(jié)果以及對助聽器或人工耳蝸植入的臨床反應(yīng)有關(guān)。耳聾的遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性可能受到環(huán)境等因素影響，使耳聾的病因診斷變得更為復(fù)雜和有挑戰(zhàn)性。因此，本文主要針對遺傳性聾基因診斷的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，為臨床醫(yī)生和科研工作者提供參考。

1 連鎖分析

多年來，連鎖分析是孟德爾疾病遺傳定位和家族聚集性復(fù)雜性狀分析的主要工具。同源染色體之間可以隨機(jī)發(fā)生交換，距離越遠(yuǎn)的等位基因相互交換重組的幾率越大，距離越近的等位基因相互交換重組的幾率越小，因此，相鄰的等位基因可以相互連鎖成連鎖群共同傳遞給后代。連鎖分析就是利用這種原理研究致病基因和遺傳標(biāo)記的關(guān)系，進(jìn)而定位致病基因的位置。通過在大家系中整合有效的共分離標(biāo)記分子，可以將包含致病突變的遺傳區(qū)間定位到確定的染色體位置[6]，用于后續(xù)多種定位克隆方法。用于連鎖分析的遺傳標(biāo)記主要有兩種，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星即短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)標(biāo)記。由于減數(shù)分裂時(shí)同源染色體隨機(jī)重組的限制，這些基因座定位方法通常篩選包含數(shù)百個(gè)基因的大型染色體區(qū)域用于后續(xù)定位克隆策略，例如：細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)介導(dǎo)的克隆[7]、從檢測組織中提取mRNA后制備的cDNA文庫[8]和根據(jù)表型假定的候選基因的選擇和檢測[9, 10],或者從已有的耳聾小鼠模型中篩選人類同源基因作為候選基因進(jìn)行測序[11, 12]，將候選基因排序并依此測序以確定致病突變。

STR連鎖分析曾定位了大量疾病相關(guān)區(qū)域，但由于解析度不夠高，通常所定區(qū)域長達(dá)十?dāng)?shù)個(gè)厘摩。特別是家系代數(shù)太少或連鎖分析標(biāo)記密度過低時(shí)還可能造成定位區(qū)域的漏查或定位分辨率過低。隨著國際人類基因組單體型圖計(jì)劃(The International HapMap project)的完成，海量SNP分型數(shù)據(jù)得以利用，同時(shí)基因分型技術(shù)也有了極大的發(fā)展。HapMap計(jì)劃之后，SNP高密度、易于自動(dòng)化和高通量操作、遺傳特性更為穩(wěn)定等特點(diǎn)使其成為新一代連鎖分析遺傳標(biāo)記。目前已有基于SNPs的商品化基因定位產(chǎn)品，利用這些SNP芯片，科學(xué)家已找到了一些遺傳性聾的致病基因。Wang等[13]采用全基因組連鎖分析結(jié)合全外顯子組測序的方法首次在中國非綜合征聾家系中鑒定了CEACAM16基因的一個(gè)新的錯(cuò)義突變c.505G4A (p.G169R)，進(jìn)一步的功能研究證實(shí)了該突變可能的致病性。Chen等[14]使用Illumina中華8芯片對一個(gè)非綜合征型聾家系進(jìn)行連鎖分析，找到了15號染色體9.86 Mb長度的致病候選區(qū)段(LOD=4.03)，其中未包含已知致病基因；結(jié)合隨后的全外顯子組測序和家系共分離驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)DMXL2基因的一個(gè)非同義突變?yōu)橹虏『蜻x位點(diǎn)。在家系較大時(shí)可用SNP芯片和外顯子組測序相結(jié)合的策略，這是目前較為廣泛采用的研究方法，基于SNP芯片的連鎖分析可以提供統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的染色體定位。有了初步定位的結(jié)果，再結(jié)合全外顯子組的位點(diǎn)篩選，可以在分析階段將候選目標(biāo)縮減至個(gè)位數(shù)位點(diǎn)。

然而，把連鎖分析直接應(yīng)用于遺傳性聾的臨床診斷存在一定缺陷：其定位通常是cM級別，不適用于難以完成共分離的小家系；其對致病性較弱的突變(如：外顯不全等)檢測能力較弱，導(dǎo)致連鎖分析在耳聾這種異質(zhì)性較高的疾病中檢測致病突變的效率很低。為了提高對致病突變的檢測效率和降低成本，基因芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

2 基因芯片技術(shù)

基因芯片也稱為突變芯片，是一種同時(shí)檢測多個(gè)突變的方法。具體原理是將序列已知的突變所在的特定DNA片段作為靶基因有序地固定在載體(如：玻璃片)上，針對靶基因設(shè)計(jì)特異性的引物，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)在樣品DNA中摻入熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(探針)；然后通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)掃描探針并獲得需要的序列信息[15]。目前，已報(bào)道的基因芯片可以檢測4～30個(gè)最常見耳聾基因的15～300個(gè)突變，包括GJB2、 SLC26A4、MTRNR1、MYO15A、OTOF、WFS1、CDH23、TECTA、COCH、POU3F4和TMC1基因[16, 17]。北京博奧生物有限公司和邁阿密大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)最近共同設(shè)計(jì)的一個(gè)DNA流體芯片(Capital Bio Miami OtoArray)，主要針對白種人最常見5個(gè)基因的變異：c.35delG, p.W24C, p.L90P, c.167delT (GJB2); 309kb deletion(GJB6); p.L236P, p.T416P (SLC26A4); and m.1555A>G, m.7444G>A (mtDNA)；其有效性和穩(wěn)定性在160個(gè)DNA樣品中得到直接測序驗(yàn)證[18]。北京博奧生物有限公司和中國人民解放軍301醫(yī)院研發(fā)的晶芯?九項(xiàng)遺傳性聾基因檢測試劑盒是中國第一個(gè)取得醫(yī)療器械注冊許可證的耳聾基因診斷芯片，目前已廣泛應(yīng)用于臨床耳聾基因診斷。此外，吳宏等設(shè)計(jì)了針對中國人群耳聾遺傳背景的具有384個(gè)位點(diǎn)的Goldengate高通量耳聾基因芯片，其中，包括240個(gè)耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)(77個(gè)顯性突變位點(diǎn)及163個(gè)隱性突變位點(diǎn))和144個(gè)SNP位點(diǎn)。應(yīng)用該耳聾基因芯片對465個(gè)DNA模板進(jìn)行篩查,統(tǒng)計(jì)分析了芯片Call rate、SNP位點(diǎn)的等位基因頻率；對一個(gè)非綜合征型顯性遺傳性聾家系進(jìn)行SNP位點(diǎn)的連鎖分析,其結(jié)果與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星定位掃描方法的定位結(jié)果相似,認(rèn)為該芯片具備初步進(jìn)行耳聾相關(guān)基因的排除定位連鎖分析的能力[19]。

基因芯片容易被制定并可以針對特定人群突變頻率進(jìn)行調(diào)整。相對于直接測序法，由于同時(shí)測序多個(gè)基因，突變芯片的費(fèi)用更低而且周期更短。然而，這種方法只能檢測芯片中所包含的基因而不能檢測新發(fā)突變；在不顯著增加成本和時(shí)間的情況下，芯片可以包含的突變有限。人類基因組計(jì)劃完成后，多種高通量測序平臺(tái)逐步推出，相對于Sanger測序法，這些快速發(fā)展的技術(shù)提高了孟德爾疾病致病基因檢測的效率和準(zhǔn)確性，并適用于不符合連鎖分析條件的小家系研究，被稱為二代測序(next-generation sequencing, NGS)。

3 二代測序(NGS)

雖然NGS技術(shù)最初是為研究而設(shè)計(jì)的，但它很快成為臨床上遺傳性疾病基因診斷不可或缺的工具。有數(shù)百個(gè)相關(guān)致病基因的NSHL很難通過臨床病史和聽力學(xué)檢查做出準(zhǔn)確的病因診斷；耳聾基因檢測已經(jīng)成為耳聾患者優(yōu)先選擇的診斷方法并且推薦在體格檢查、聽力學(xué)檢查和家族史確定后立即進(jìn)行[20]；這些策略正在快速應(yīng)用到臨床中。

NGS具有多種不同的形式：靶向捕獲測序基因包(panel)、對所有編碼外顯子測序的全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)和對完整基因組測序的全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)[21]。據(jù)估計(jì)，約85%的孟德爾疾病的致病突變發(fā)生在編碼區(qū)或外顯子與內(nèi)含子交界的剪接位點(diǎn)區(qū)域，使得靶向富集和MPS方法更為高效[22]。此外，自2008年以來，全基因組測序成本已經(jīng)降到1 000美元以內(nèi)，2017年，Illumina 公司推出NovaSeq測序儀，使全外顯子組測序價(jià)格有望降到100美元。測序技術(shù)的日益完善和測序成本的逐漸降低，使得NGS技術(shù)更廣泛地應(yīng)用到遺傳性疾病的診斷中。

既往認(rèn)為只需對疑似先天性感音神經(jīng)性聾或未通過新生兒聽力篩查的人群進(jìn)行基因篩查[23],因而只有約三分之一的耳聾患者在接受基因檢測后得到了明確的分子診斷。最近的指南建議對所有未通過新生兒聽力篩查的嬰兒進(jìn)行GJB2突變的篩查[24]。雖然有所進(jìn)步，但仍會(huì)漏篩非GJB2突變引起的非綜合征型感音神經(jīng)性聾，以及出生時(shí)聽力正常、但可能攜帶引起遲發(fā)性聾的基因突變者。

導(dǎo)致遺傳性聾漏診的主要原因有以下三個(gè)方面：由于缺乏足夠數(shù)據(jù)無法解釋鑒定出的基因變異，測序?qū)ο笾话司幋a區(qū)和剪接位點(diǎn)，以及基因測序只局限于已知的耳聾基因[2]。然而，基因檢測技術(shù)的進(jìn)步，如：耳聾靶向捕獲測序panel，將越來越多地應(yīng)用于SHL和NSHL的病因診斷。

自2004年推出首個(gè)NGS技術(shù)以來，已有1 000多篇與之相關(guān)的文章發(fā)表，已鑒定出了十多個(gè)耳聾基因[25]。第一個(gè)用靶向二代測序方法鑒定的耳聾基因是TPRN，該基因位于常染色體隱性遺傳DFNB79基因座上，編碼一種叫做Taperin的感覺上皮蛋白[26]。從那時(shí)起，應(yīng)用基因座靶向富集技術(shù)， SMPX[27]、GRXCR2[28]以及CLIC5[29]等更多的基因先后被鑒定出來，這些新發(fā)現(xiàn)的耳聾基因加上之前已知的耳聾基因，為研發(fā)全面的靶向捕獲測序panel提供了基礎(chǔ)。靶向捕獲測序panel可以大規(guī)模平行地測序數(shù)百種基因，與傳統(tǒng)的Sanger測序相比，能以更低的成本更快地獲得結(jié)果。Usher 綜合征是常染色體隱性遺傳病，Shu等[30]使用199個(gè)基因的panel進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)了USH2A基因上的一個(gè)新的突變位點(diǎn)c.13156A>T，該突變與IVS47 + 1G>A突變形成復(fù)合雜合突變；經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，該突變在家系中符合共分離規(guī)律。

OtoGenomeTM測序就是靶向捕獲測序panel之一，是由Partners Health Care Personalized Medicine的分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的一種基于panel的基因測序工具，能夠篩查70多個(gè)與遺傳性聾有關(guān)的基因，周轉(zhuǎn)時(shí)間為8～12周；其在非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者個(gè)體和人群研究中發(fā)揮著重要的作用，如：在猶太人群中識別出了OTOF基因的變異[31]。另外一個(gè)基于基因panel的靶向二代測序就是耳科致病性外顯子序列捕獲(otological sequence capture of pathogenic exons，OtoSCOPE) panel，由美國愛荷華大學(xué)于2010年研發(fā)[32]。OtoSCOPE能夠篩查超過150個(gè)已知的導(dǎo)致非綜合征型感音神經(jīng)性聾、Usher綜合征和Pendred綜合征的基因，其周轉(zhuǎn)時(shí)間為3個(gè)月。最近OtoSCOPE panel用于研究喀麥隆一個(gè)常染色體隱性非綜合征型感音神經(jīng)性聾家系的遺傳病因[33]。前庭水管擴(kuò)大(enlarged vestibular aqueduct, EVA)是一種最常見的先天性內(nèi)耳畸形，可導(dǎo)致聽力障礙，劉亞蘭等[34]基于 Illumina?Miseq 測序平臺(tái)的目標(biāo)區(qū)域捕獲高通量測序技術(shù)，建立了針對 EVA 三個(gè)致病基因(SLC26A4、 FOXI1 和KCNJ10) 的目標(biāo)區(qū)域捕獲體系及多重 PCR 富集體系，同時(shí)建立基于 CNVplex 技術(shù)的目標(biāo)區(qū)域 CNV 檢測體系，開發(fā)了可同時(shí)檢測SNV/CNV 的 EVA 基因診斷panel；并在46例中國EVA 患者中驗(yàn)證了該 EVA 基因診斷panel的臨床應(yīng)用價(jià)值。

靶向捕獲測序panel也被廣泛用于檢測致病基因變異。最近由邁阿密耳科遺傳學(xué)研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)的Miami OtoGenes panel可以篩查超過180個(gè)耳聾相關(guān)基因，其周轉(zhuǎn)時(shí)間為3～4周，費(fèi)用為212～305美元[35]。該panel最近被用于對四大洲多種族個(gè)體的廣泛研究，并確定了非綜合征型感音神經(jīng)性聾的DNA變異譜，并在25%的多發(fā)家系和7%的單發(fā)家系中發(fā)現(xiàn)了致病的DNA變異。從民族多樣性的樣本中得到的數(shù)據(jù)對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫有很大的貢獻(xiàn)，并且可以提高某些非綜合征型感音神經(jīng)性聾基因變異致病性的檢測和解釋能力。基于病例的靶向測序panel也被用于進(jìn)一步研究已知的耳聾變異和突變，從而加深對非綜合征型感音神經(jīng)性聾的遺傳解釋。以2015年的一項(xiàng)研究報(bào)告為例，該研究在一個(gè)非綜合征型感音神經(jīng)性聾家系中發(fā)現(xiàn)了PDZD7基因，此前有臨床報(bào)告認(rèn)為該基因與Usher綜合征有關(guān)，但應(yīng)用一個(gè)定制設(shè)計(jì)的包含151個(gè)耳聾基因的靶向捕獲測序panel檢測該家系，卻證實(shí)PDZD7是常染色體隱性非綜合征型感音神經(jīng)性聾的真正病因[36]。

隨著疾病特異的大規(guī)模的靶向捕獲測序panel繼續(xù)應(yīng)用于耳聾研究以發(fā)掘常見的基因變異，這些信息可以進(jìn)一步按照種族群體或地區(qū)進(jìn)行分層，并被開發(fā)成更小、更有針對性的診斷panel應(yīng)用于臨床。在耳聾研究領(lǐng)域，特定種族特異性的基因圖譜正在越來越快被鑒定出來。Shafique等[37]報(bào)道了巴基斯坦家系中常染色體隱性非綜合征型感音神經(jīng)性聾基因的遺傳譜。Ouyang等[38]強(qiáng)調(diào)中國人群中非綜合征型感音神經(jīng)性聾中的遺傳基礎(chǔ)，并在其他特定的耳聾人群中開展了延續(xù)性的研究[36, 37]。因此，那些未包含在針對多種群體的基因panel中的罕見基因和突變可以納入到定制的特異人群基因panel中。例如，非綜合征型感音神經(jīng)性聾中相對罕見的致病基因，如MYO7A、MYO3A、SLC26A4等，非洲裔耳聾患者的攜帶比例卻較高，因此，將這些基因納入非洲特定人群的基因panel將會(huì)有利于這些人群耳聾的病因診斷[39]。

全外顯子組測序(WES)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)耳聾新基因的重要方法。通過針對基因組的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的捕獲測序，WES減少了全基因組測序(WGS)所需的時(shí)間和費(fèi)用。國內(nèi)外學(xué)者使用全外顯子組測序已在非綜合征型感音神經(jīng)性聾中發(fā)現(xiàn)了GPSM2和OTOGL等耳聾基因，以及MASP1和DNMT1等綜合征型感音神經(jīng)性聾致病基因。最近，有研究應(yīng)用全外顯子組測序在一個(gè)常染色體顯性遺傳性語后聾的非綜合征型感音神經(jīng)性聾中國家系中發(fā)現(xiàn)了SLC44A4基因的致病變異[40]。另一個(gè)研究小組在一個(gè)5代人均患有綜合征型感音神經(jīng)性聾的中國家系中，應(yīng)用靶向X染色體外顯子組測序發(fā)現(xiàn)了GPRASP2基因的一個(gè)致病變異[41]。在一個(gè)馬來西亞家系中應(yīng)用全外顯子組測序鑒定出SLC26A4、GJB2、SCARB2和DUOX2等多個(gè)基因的變異，這些基因可能是Pendred綜合征的致病基因[42]。此外，全外顯子組測序還應(yīng)用于不適合連鎖分析的小家系中，進(jìn)行純合子定位(homozygosity mapping)。使用這種方法，研究者們已經(jīng)在非綜合征型聾近親家系中發(fā)現(xiàn)了50多個(gè)隱性耳聾基因座，包括在一個(gè)巴勒斯坦非綜合征型聾近親家系中發(fā)現(xiàn)的GPSM2細(xì)胞極性蛋白基因變異[43]。耳聾-甲營養(yǎng)不良綜合征(DDOD syndrome，MIM 124480)主要表現(xiàn)為指甲發(fā)育不良或缺失，伴隨先天性感音神經(jīng)性聾。Yuan等[44]使用全外顯子組測序?qū)?個(gè)中國核心三人家系篩查，發(fā)現(xiàn)了ATP6V1B2基因的無義突變；基因敲除小鼠模型和體外細(xì)胞功能研究進(jìn)一步證實(shí)ATP6V1B2 c.1516 C>T是一個(gè)單倍體不足突變。2016年，Cai等[45]使用全外顯子組測序在一個(gè)中國非綜合征型遺傳性聾家系中發(fā)現(xiàn)了已知POU4F3基因的一個(gè)新移碼突變c.602delT, p.L201fs。2017年，牛志杰等[46]使用全外顯子組測序在一個(gè)中國X連鎖非綜合征型遺傳性聾家系中發(fā)現(xiàn)SMPX基因的一個(gè)新的移碼突變c.217dupA, p.Ile73Asnfs*5。

純合子定位是確定常染色體隱性基因座的另一種方法，尤其適合于近親婚配的家系[47]和具有相似臨床癥狀的人群[48]。純合子定位可以將目標(biāo)基因定位到某一染色體的特定區(qū)域，為WES測序和分析提供候選區(qū)域并佐證WES數(shù)據(jù)分析結(jié)果。大量研究證實(shí)，WES結(jié)合純合子定位是遺傳性聾致病基因檢測的有效工具。Delmaghani等[49]在一個(gè)DFNB大家系中，應(yīng)用純合子定位將目標(biāo)區(qū)域定位在1p21.2-1p21.1的大小約2.8 Mb的區(qū)域，然后通過WES技術(shù)在這個(gè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了致病基因CDC14A；利用類似方法還檢測出了GPSM2[43]、OTOGL[50]等耳聾基因。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)院(ACMG)將WES篩選出的候選致病基因能夠在家系中完成共分離作為致病基因的支持證據(jù)[51]，利用Sanger測序在家系其他成員中驗(yàn)證候選致病基因并完成家系共分離已成為驗(yàn)證新變異的常規(guī)措施。

目前，NGS技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，而測序數(shù)據(jù)的完整解讀是NGS技術(shù)應(yīng)用的一大挑戰(zhàn)，需要多個(gè)不同領(lǐng)域的專家：遺傳學(xué)家、統(tǒng)計(jì)學(xué)家、生物信息學(xué)家、生物學(xué)家和臨床醫(yī)生，以便找出遺傳性疾病確切的致病變異[52]，因而，最大的改進(jìn)之處也在于計(jì)算機(jī)設(shè)施和開發(fā)用于生物信息分析的高效準(zhǔn)確的算法。最近開發(fā)的一種生物信息學(xué)pipeline能夠進(jìn)行有效的WGS分析，包括：比對、比對后處理和基因分型，并為后續(xù)費(fèi)時(shí)不足2小時(shí)的臨床解讀產(chǎn)生一個(gè)變異列表[53]。另一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域是對NGS數(shù)據(jù)的拷貝數(shù)變異(copy number variantion, CNV)分析，由于實(shí)驗(yàn)噪聲以及在目標(biāo)捕獲和擴(kuò)增過程中引入的偏差和偽像，使得利用WES數(shù)據(jù)分析CNV變得非常復(fù)雜，并且WES的深度和覆蓋率可能并不總是準(zhǔn)確地反映真實(shí)的拷貝數(shù)[54]。最近開發(fā)的算法越來越多，旨在解決CNV問題，以減少假陽性和假陰性結(jié)果。 CNVs是NSHL的一個(gè)特別重要的致病因素，從一項(xiàng)研究中可以確定，約15%的NSHL患者在已知的耳聾基因中至少攜帶一個(gè)CNV[55]。艾吉泰康公司最近推出一款針對漢族人遺傳特征制定的AlWholeExome外顯子試劑盒，使用中國漢族人DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)作對照，并可分析大于100 k區(qū)域的CNV變異。

4 其他耳聾基因熱點(diǎn)突變檢測技術(shù)

除了上述技術(shù)，目前應(yīng)用于臨床的遺傳性耳聾的基因診斷技術(shù)還包括：直接測序法、PCR-RFLP、質(zhì)譜分析以及熒光PCR法等。目前直接測序法仍是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其得出的結(jié)果直觀、準(zhǔn)確可靠，讀長較長，既可發(fā)現(xiàn)已知突變，也可發(fā)現(xiàn)未知突變，廣泛應(yīng)用于GJB2、SLC26A4以及線粒體12SrRNA的全序列分析，但其通量低，成本較高，不適用于大規(guī)模臨床推廣。PCR-RFLP可以明確地確定突變的有無和位置，但需在突變位點(diǎn)處存在酶切位點(diǎn)或能夠引入某種酶切位點(diǎn)；目前已有商品化的基于PCR-RFLP技術(shù)的線粒體12SrRNA A1555G突變的檢測試劑盒。質(zhì)譜分析通過使用物理方法(激光)使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同而被檢測，根據(jù)測得的樣品分子量，進(jìn)而推知突變位點(diǎn)，主要應(yīng)用于分析單核苷酸多態(tài)性和短串聯(lián)重復(fù)序列，可進(jìn)行微測序；目前已有商品化的基于質(zhì)譜分析的20個(gè)耳聾基因熱點(diǎn)突變的檢測試劑盒，但該方法的缺點(diǎn)是分辨率低。熒光PCR技術(shù)也被應(yīng)用于耳聾基因檢測，針對突變位點(diǎn)的野生型和突變型，設(shè)計(jì)一對不同熒光標(biāo)記的探針，模擬天然DNA的復(fù)制，通過PCR擴(kuò)增，與模板DNA高度特異的結(jié)合，收集熒光累積曲線，實(shí)時(shí)讀取定性結(jié)果；目前已有商品化的基于熒光PCR的14個(gè)耳聾基因熱點(diǎn)突變的檢測試劑盒并被應(yīng)用于臨床。此外，市面上還有基于導(dǎo)流雜交技術(shù)，將PCR和低密度基因芯片技術(shù)結(jié)合用于檢測4個(gè)耳聾相關(guān)基因的13個(gè)突變位點(diǎn)的試劑盒。上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究人員和臨床工作者可以針對不同的研究和臨床需求選擇合適的技術(shù)進(jìn)行耳聾基因檢測。

5 展望

隨著高通量測序平臺(tái)和數(shù)據(jù)分析的不斷完善以及測序費(fèi)用的降低，基因檢測技術(shù)已從單基因水平發(fā)展到全基因組水平，NGS必將在包括耳聾在內(nèi)的遺傳性疾病的臨床診斷和科學(xué)研究中發(fā)揮更大作用。例如，在耳聾高危家系中進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，可以降低后代耳聾的患病率；然而，對檢測結(jié)果的分析仍然存在挑戰(zhàn)。目前中國還缺乏完整的數(shù)據(jù)庫，生物信息分析和解讀時(shí)效低、成本高，從生物信息學(xué)到NGS診斷還面臨很大的挑戰(zhàn)。

不同種族或人群攜帶的遺傳信息和遺傳性疾病相關(guān)的變異信息并不完全相同，例如，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種耳聾相關(guān)的GJB2突變，但中國人群中只報(bào)道了20多種；235delC突變在東亞人群中最常見，而35delG突變在歐洲高加索人群中多見[38]。因此，為了充分了解不同種族人群的基因和疾病信息，國際不同機(jī)構(gòu)和研究者之間的合作越來越多，對于耳聾這種異質(zhì)性較高的疾病，更需要相互合作才能早日了解遺傳性疾病的遺傳圖譜。劉學(xué)忠教授與印度、突尼斯、意大利、尼日利亞、土耳其、南非和危地馬拉等多個(gè)國家合作，收集了342個(gè)GJB2突變陰性家系，利用180個(gè)耳聾基因的panel(MiamiOtoGenes)檢測多種族耳聾基因變異譜[2]，這種模式必將提高相關(guān)國家對耳聾的診斷和治療水平。