細(xì)梗香草的抗腫瘤作用研究進(jìn)展

許雅思, 丁藝暉, 高 佳, 張仕蓉

(1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，浙江 杭州 310006；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310006；3. 杭州市第一人民醫(yī)院心臟外科，浙江 杭州 310006；4. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院胃腸外科，浙江 杭州 310006)

細(xì)梗香草(LysimachiacapillipesHemsl，L.capillipes)，又名香排草、香草、毛柄珍珠菜，載于《中國植物志》《浙江省植物志》《廣西植物名錄》等,系報(bào)春花科(Primulaceae)珍珠菜屬植物，主要分布于我國華南、西南地區(qū)。民間主要用于治療感冒咳喘、風(fēng)濕痛、神經(jīng)衰弱、月經(jīng)不調(diào)、虛弱等。該植物的藥理活性主要體現(xiàn)在清熱解毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等方面。其化學(xué)成分主要包含：皂苷類，以細(xì)梗香草皂苷B(Lysimachia capilliposide B，LC-B)和C(Lysimachia capilliposide C，LC-C)這兩個(gè)化合物為主，其含量占總皂苷的70%以上[1]；黃酮類，從L.capillipes中分離出的黃酮類化合物，包括黃酮和黃酮醇類以及它們的苷[2-3]；甾醇類化合物，從L.capillipes中分離出8個(gè)化合物，其中化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)為全順式-5-脫氧戊糖酸-γ-內(nèi)酯[3-4]；揮發(fā)性成分，L.capillipes的揮發(fā)性成分主要為有機(jī)酸類(不同鏈長的飽和酸、不飽和酸，以及芳香酸、二羧酸等)和揮發(fā)油(六氫金合歡烯酰丙酮、苯乙醇、香葉基丙酮等)[5]。

傳統(tǒng)的化療藥物在治療惡性腫瘤的過程中帶來的生存獲益有限，且存在一定的毒副反應(yīng)。祖國傳統(tǒng)的中草藥在腫瘤治療中具有增效減毒的獨(dú)特優(yōu)勢，比如皂苷類，具有抗炎、抗腫瘤等活性，其通過很多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等發(fā)揮作用[6-8]。LC-B和LC-C為L.capillipes中主要的皂苷類成分。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，L.capillipes可以有效抑制多種癌細(xì)胞的增殖，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、卵巢癌等。鑒于L.capillipes對(duì)腫瘤的作用機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)對(duì)該植物的抗腫瘤藥理活性綜述如下。

1 抗腫瘤作用機(jī)制

研究表明，LC-B對(duì)人卵巢癌A-2780細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用(IC50為0.1 mg·L-1)[9]。LC-C抑制人肺癌A549和乳腺癌MCF7細(xì)胞的生長，IC50分別為 0.433 4 μmol·L-1和0.607 4 μmol·L-1[10]。Li等[11]發(fā)現(xiàn)，LC-C可以劑量和時(shí)間依賴性抑制人前列腺癌細(xì)胞PC-3(IC50為5.33 μmol·L-1)和 DU145(IC50為9.99 μmol·L-1)生長，并抑制其細(xì)胞集落形成。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，不同濃度細(xì)梗香草總皂苷(Lysimachia capilliposide，LC)對(duì)H460 肺癌細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性[12]。體內(nèi)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，LC可劑量依賴性地抑制多種腫瘤細(xì)胞荷瘤裸鼠腫瘤的生長，在前列腺癌、胃癌及卵巢癌中的抑瘤率分別為58.7%、56.2%、55.7%[13]。

1.1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Li等[11]發(fā)現(xiàn)LC-C能夠誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡，同時(shí)降低線粒體膜電位水平；并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑,下調(diào)Bcl-2、JNK、p38 α/β，上調(diào)Bax、p-JNK、p-p38?；ㄓ篮绲萚14]發(fā)現(xiàn)，LC對(duì)鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞株有誘導(dǎo)凋亡的作用，其凋亡率達(dá)16.4%；作者通過構(gòu)建p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA)干擾載體(PUMA-siRNA)，發(fā)現(xiàn)L.capillipes誘導(dǎo)凋亡與上調(diào)PUMA-Bax途徑有關(guān)[15]。我們也發(fā)現(xiàn)，LC作用后的H460細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別是19.8%和28.9%[12]。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及維持過程中扮演著多種角色[16]。細(xì)胞中ROS的激增導(dǎo)致了細(xì)胞周期的阻滯，同時(shí)也引發(fā)了細(xì)胞凋亡[17]。在研究LC對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)影響的實(shí)驗(yàn)中[18]，高濃度LC作用的H460細(xì)胞中含有更高水平的ROS，還可使H460細(xì)胞IκB、Bax和caspase-3表達(dá)增加，而使NF-κB和Bcl-2 表達(dá)降低。Li等[11]應(yīng)用DCFH-DA熒光探針檢測不同濃度LC-C作用下的前列腺癌PC-3細(xì)胞株中的ROS水平，結(jié)果表明LC-C能增加ROS水平。結(jié)合LC劑量依賴性地促使細(xì)胞凋亡，這些數(shù)據(jù)表明L.capillipes能夠增加ROS水平，抑制NF-κB通路，促進(jìn)下游促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，激活caspase-3酶來執(zhí)行凋亡命令，最終激活了線粒體凋亡途徑[19]。

1.2腫瘤細(xì)胞周期阻滯費(fèi)正華等[12]利用流式細(xì)胞術(shù)分析LC作用后的H460細(xì)胞周期情況，結(jié)果表明LC劑量依賴性地促使H460細(xì)胞被阻滯在S期，相比于對(duì)照組S期12.4%的阻滯率，不同濃度LC(2、4、6 mg·L-1)作用下的H460細(xì)胞的S期阻滯率分別是22.7%、34.8%、44.0%。細(xì)胞內(nèi)存在一系列監(jiān)控機(jī)制，確保細(xì)胞周期各時(shí)相轉(zhuǎn)化有序進(jìn)行，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的進(jìn)程是密切相關(guān)的，當(dāng)DNA受損或復(fù)制不完全時(shí)，細(xì)胞周期將停留于某一時(shí)相，待DNA修復(fù)或復(fù)制完全后，方可進(jìn)入下一時(shí)相，若DNA不能修復(fù)或不能完全復(fù)制，則啟動(dòng)凋亡機(jī)制，引起細(xì)胞凋亡。由于S期細(xì)胞群的增加，伴隨著的是G0/G1期和G2/M期細(xì)胞群的減少，H460細(xì)胞大量在S期堆積，阻止了向G2/M期的轉(zhuǎn)變，減緩癌細(xì)胞有絲分裂過程，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速凋亡。

1.3抗腫瘤血管生成腫瘤血管的形成對(duì)直徑大于3 mm的實(shí)體瘤的進(jìn)一步生長極其重要，腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的過程是一個(gè)多種正、負(fù)因素共同作用的結(jié)果。有研究表明，三萜皂苷可能通過受體酪氨酸激酶以及VEGF/VEGFR信號(hào)通路，抑制血管增生[20]。徐燕等[13]研究胃癌BGC-823裸鼠腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示，L.capillipes高劑量組VEGF表達(dá)與模型組相比明顯減少，提示L.capillipes可能通過抑制VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤生長。

1.4增強(qiáng)免疫活性通過建立人源腫瘤裸鼠的移植模型，檢測脾T淋巴細(xì)胞增殖情況和IL-2活性，發(fā)現(xiàn)LC可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)性，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能，從而促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)[13]。

2 聯(lián)合抗腫瘤作用

晚期腫瘤治療的最大難題是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥。目前治療上多采用包括化療、靶向、放療及外科在內(nèi)的綜合治療，中藥聯(lián)合這些治療手段成為目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

2.1聯(lián)合靶向及化療表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變基因的發(fā)現(xiàn)和受體酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的發(fā)展，給NSCLC患者帶來了新的曙光。然而,第一代TKIs (吉非替尼和厄洛替尼)的有效期僅為10～16個(gè)月，大約50%的耐藥患者是因?yàn)槌霈F(xiàn)了繼發(fā)或原發(fā)性T790M基因突變。Zhang等[21]探索了LC合用吉非替尼對(duì)于NSCLC的效果，結(jié)果顯示LC不僅協(xié)同提高了吉非替尼抑瘤能力，而且恢復(fù)了耐藥細(xì)胞對(duì)于吉非替尼的敏感性。LC合用明顯增加了吉非替尼對(duì)其耐藥細(xì)胞PC-9-GR(EGFR T790M突變)的抑制水平，IC50值從(6.80 ± 1.00)μmol·L-1降到(0.77 ± 0.12)μmol·L-1。進(jìn)一步探索機(jī)制發(fā)現(xiàn)，LC合用吉非替尼明顯降低了EGFR下游信號(hào)通路Akt蛋白水平，而兩藥單用對(duì)Akt均無明顯影響。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，接種PC-9-GR細(xì)胞的移植瘤小鼠模型中，LC和吉非替尼合用明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，我們的前期數(shù)據(jù)顯示，LC可能通過表觀遺傳修飾，逆轉(zhuǎn)人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞的化療敏感性。

2.2聯(lián)合放療放射治療作為腫瘤綜合治療的重要組成部分，在腫瘤治療各階段發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞主要通過兩種主要的途徑來完成修復(fù)放療導(dǎo)致的DNA損傷，分別是同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。HR以姐妹染色單體為模板，對(duì)DNA雙鏈斷裂進(jìn)行的高保真修復(fù)，其主要作用于細(xì)胞周期的S期和G2期[22]。NHEJ相較HR是一種非高保真修復(fù)方式，其可在所有細(xì)胞周期上發(fā)生，但主要在細(xì)胞周期的G1期和M期[23]。LC單用或合用化療顯示出了良好的抗腫瘤作用，但與放療聯(lián)合的研究尚缺乏。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LC聯(lián)合放療作用于H460和H1299的放療增敏比分別為1.67和2.07，顯示出良好的放療增敏作用[24]。進(jìn)一步研究顯示，LC聯(lián)合放療和單純放療組作用于H460細(xì)胞，凋亡率分別為30.5%和15.2%，作用于PC-9細(xì)胞，兩組凋亡率分別為30.6%和14.6%，提示LC可以明顯提高放療對(duì)肺癌細(xì)胞的促凋亡作用。Western blot顯示，LC聯(lián)合放療增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2。作者構(gòu)建3種報(bào)告基因的骨髓瘤細(xì)胞282細(xì)胞(NHEJ)、280細(xì)胞(HR)、283細(xì)胞(SSA)，LC作用后，282細(xì)胞比例減少了34%，280細(xì)胞未見明顯改變，而283細(xì)胞輕度升高，提示LC對(duì)NHEJ修復(fù)具有明顯抑制作用。然后對(duì)NHEJ通路相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，DNA-PKcs、RAD50、Ku70/Ku80明顯下降。敲除DNA-PKcs后，LC放療增敏作用大大減弱，這印證了LC具有良好的放療增敏作用，并且這一放療增敏作用是與NHEJ途徑有關(guān)。

3 小結(jié)

L.capillipes具有明顯的抗腫瘤作用，其抗腫瘤的主要機(jī)制包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、抗血管生成等，合用靶向、化療以及放療表明L.capillipes有很好的開發(fā)前景。L.capillipes相關(guān)的臨床和藥理研究報(bào)道并不多，作為藥效廣泛和資源豐富的民間藥用植物，有必要深入研究該植物的藥理作用機(jī)制，為充分發(fā)揮其抗腫瘤作用提供科學(xué)依據(jù)。