實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法建立小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h1>

2018-01-24 06:24:20時(shí)玉霞李茹柳王東旭朱易平陳蔚文

中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)訂閱 2018年2期 收藏

關(guān)鍵詞：試藥藥效培養(yǎng)液

時(shí)玉霞，李茹柳，鄧 嬌，王東旭，朱易平，胡 玲，陳蔚文

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東 廣州 510405)

胃腸黏膜通過上皮細(xì)胞遷移、增殖、分化、凋亡等以維持黏膜完整性的動(dòng)態(tài)平衡，胃腸黏膜是人體更新速度最快的組織，胃腸上皮細(xì)胞增殖是維持胃腸黏膜完整性的生理特征之一[1]。檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法包括間接觀察DNA合成含量和直接檢測(cè)細(xì)胞代謝活性等。檢測(cè)細(xì)胞存活狀況的方法有3H-TdR參入法、MTT法、WST法、CCK-8法等，但這些方法都不能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，且受多種因素的影響[2]。實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(real-time cell analyzer，RTCA)是實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)的電感應(yīng)儀，細(xì)胞貼壁于E-Plate板底部時(shí)，其電極電阻值會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)[3]，可通過細(xì)胞指數(shù)曲線的方式實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)(主要是增殖)情況，且較少受其它因素干擾。表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸磷酸化以促進(jìn)細(xì)胞增殖，在胃腸道，EGF可增加上皮細(xì)胞鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)活性，刺激黏膜DNA合成，維持胃腸黏膜上皮正常功能[4]。本實(shí)驗(yàn)以RTCA建立小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)生長(zhǎng)模型，以EGF作為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的工具藥，觀察不同培養(yǎng)條件對(duì)IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及EGF的藥效，為建立IEC-6細(xì)胞增殖藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁﹨⒖肌?/p>

1 材料

1.1試劑重組人EGF(批號(hào)0815AFC05，美國(guó)Peprotech公司)；胎牛血清(批號(hào)1671324)、高糖DMEM(批號(hào)8115346)、雙抗Pen Strep(批號(hào)1677648)，均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；海藻糖D-Trehalose(分子質(zhì)量：378.33，批號(hào)T-5251，美國(guó)Sigma公司)；其他試劑均為分析純。

1.2儀器xCELLigence RTCA DP(實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析儀)、E-Plate 16(批號(hào)20140224)，均為瑞士羅氏公司產(chǎn)品；3111型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.3細(xì)胞大鼠小腸隱窩細(xì)胞(IEC-6)購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC)，批號(hào)58541019。選擇22～24代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1EGF的配制EGF試劑開蓋前先離心試劑管(10 000 r·min-1，30 s)，加滅菌超純水200 μL到該試劑管，靜置5 min使其充分溶解，再加80 μL含5%海藻糖的PBS溶液，配成終濃度0.1 g·L-1的EGF，分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩：罄m(xù)稀釋EGF時(shí)，均用含5%海藻糖的PBS溶液。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞以2×104cells/cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為高糖DMEM含10% FBS和1%雙抗；培養(yǎng)條件為37℃，飽和濕度，5% CO2。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于E-Plate 16板，每孔加入200 μL含10%血清和1%雙抗的DMEM，培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液換成200 μL無(wú)血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)20 h(即血清饑餓20 h)。

3 結(jié)果

3.110%血清濃度時(shí)EGF對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響按“2.2”培養(yǎng)方法，血清饑餓20 h后，每孔更換200 μL培養(yǎng)液；空白對(duì)照組為含10%血清的DMEM 200 μL，受試藥組分別加入終濃度為1、10、100 μg·L-1EGF的10%血清的DMEM 200 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，分別觀察給藥后24、48、72 h細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)；各組細(xì)胞指數(shù)及其生長(zhǎng)曲線圖由儀器配套軟件自動(dòng)計(jì)算并導(dǎo)出。由Fig 1、Tab 1結(jié)果可見，細(xì)胞加藥后24、48、72 h，EGF各劑量組細(xì)胞指數(shù)與空白組比較均P>0.05，表明EGF在10%血清濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。提示培養(yǎng)液含10%血清時(shí)，不能反映EGF促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥效。

Fig 1 Efficacy of EGF on cell growthunder serum concentration of 10%

Tab 1 Efficacy of EGF on cell growth underserum concentration of 10%(±s, n=3)

3.2無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)(0%血清)EGF對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響按“2.2”培養(yǎng)方法，血清饑餓20 h后，每孔更換200 μL DMEM；“5%血清空白組”為培養(yǎng)液加入含5%血清的DMEM，“0%血清空白組”加入不含血清的DMEM，給藥組分別加入含終濃度1、10、100 μg·L-1EGF的不含血清DMEM；每組3個(gè)復(fù)孔，觀察給藥后24、48、72 h細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。由Fig 2、Tab 2結(jié)果可見，無(wú)血清培養(yǎng)可致細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制(0%血清空白組細(xì)胞指數(shù)與5%血清空白組比較，在24、48、72 h均P<0.01)；EGF對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)所致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制有一定改善作用(1、10 μg·L-1的EGF組與0%血清空白組比較，細(xì)胞指數(shù)在48、72 h均P<0.01)，說明EGF對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但不能使其恢復(fù)至正常水平(與5%血清組比較，均P<0.01)。提示培養(yǎng)液不含血清時(shí)，不能較好反映EGF促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥效。Fig 2結(jié)果還提示，5%血清能較好維持細(xì)胞生長(zhǎng)，但也不利于體現(xiàn)EGF促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥效，應(yīng)適當(dāng)調(diào)低血清濃度，以利于反映EGF藥效。

Fig 2 Efficacy of EGF on cell growth underserum concentration of 0%

3.3不同血清濃度(0%、0.5%、1%)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響按“2.2”培養(yǎng)方法，血清饑餓20 h后，每孔更換200μL DMEM，設(shè)0%、0.5%、1%血清濃度組，每組3個(gè)復(fù)孔，觀察加入不同濃度血清培養(yǎng)24、48、72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。由Fig 3、Tab 3結(jié)果可見，不同濃度血清可致細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯差異。無(wú)血清培養(yǎng)(0%血清)可明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；1%血清濃度可維持細(xì)胞指數(shù)處于上升階段約48 h，后續(xù)則細(xì)胞指數(shù)逐漸下降；0.5%血清濃度可維持細(xì)胞指數(shù)處于上升或平臺(tái)階段約36 h，后續(xù)則細(xì)胞指數(shù)逐漸下降。提示0.5%血清既不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制，也不會(huì)由于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)而不利于反映EGF藥效。

Tab 2 Efficacy of EGF on cell growth under serum concentration of 0%(±s, n=3)

##P<0.01vs5% serum group;**P<0.01vsserum-free group

Fig 3 Efficacy of different serum concentrations on cell growth

GroupCellindex0h24h48h72h0%serum4．98±0．173．25±0．171．34±0．070．83±0．060．5%serum4．67±0．986．33±0．47??5．08±0．73??3．96±0．68??1%serum4．02±0．356．47±0．05??6．88±0．08??5．72±0．20??

**P<0.01vsserum-free group

3.40.5%血清濃度時(shí)EGF對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響按“2.2”培養(yǎng)方法，血清饑餓20 h后，每孔更換200 μL培養(yǎng)液；空白對(duì)照組為含0.5%血清的DMEM，受試藥組為在含0.5%血清的DMEM中分別加入EGF，使其終濃度為1、10、50、100 μg·L-1。每組3個(gè)復(fù)孔，觀察加藥24、48、72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。由Fig 4、Tab 4可見，加藥24 h內(nèi)，EGF各劑量組與空白對(duì)照組生長(zhǎng)曲線基本相似(加藥24 h時(shí)EGF各組細(xì)胞指數(shù)與空白對(duì)照組比較均P>0.05)；加藥48～72 h，空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線明顯下降，EGF 1、10 μg·L-1組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本維持在平臺(tái)期，EGF 50、100 μg·L-1組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線則緩慢下降，EGF各組細(xì)胞指數(shù)與空白組比較均P<0.01。提示0.5%血清培養(yǎng)時(shí)可體現(xiàn)EGF促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥效，其中1、10 μg·L-1組藥效較優(yōu)；為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇EGF(10 μg·L-1) 進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 4 Efficacy of EGF on cell growth underserum concentration of 0.5%

Tab 4 Efficacy of EGF on cell growth underserum concentration of 0.5%(±s, n=3)

**P<0.01vscontrol

3.50.5%血清濃度時(shí)EGF(10μg·L-1)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響按“2.2”培養(yǎng)方法，血清饑餓20 h后，每孔更換200 μL培養(yǎng)液，空白對(duì)照組為含0.5%血清的DMEM，受試藥組在含0.5%血清的DMEM中加入EGF，使其終濃度為10 μg·L-1。每組3個(gè)復(fù)孔，觀察加藥24、48、72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。由Fig 5、Tab 5結(jié)果可見，加藥48 h后，空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線明顯下降，EGF組(10 μg·L-1)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本維持在平臺(tái)期，加藥48、72 h時(shí)，EGF組生長(zhǎng)指數(shù)與空白對(duì)照組比較P<0.05或P<0.01，與Fig 4、Tab 4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，重復(fù)驗(yàn)證了0.5%血清濃度時(shí)可反映EGF促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)藥效的結(jié)果。

Fig 5 Efficacy of EGF(10 μg·L-1)on cell growthunder serum concentration of 0.5%

GroupConcentration/μg·L-1Cellindex0h24h48h72hControl-4．67±0．986．33±0．475．10±0．713．96±0．68EGF104．66±0．846．35±0．106．49±0．20?6．57±0．23??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

4 討論

胃腸黏膜具有消化、吸收、分泌和免疫屏障等功能，細(xì)胞增殖是維持胃腸黏膜完整性和正常功能的重要因素，也是胃腸黏膜損傷修復(fù)的重要環(huán)節(jié)[5]。促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖是胃腸黏膜損傷修復(fù)藥物如益氣健脾中藥白術(shù)、黃芪等的藥理作用之一[6]。本課題組以RTCA檢測(cè)白術(shù)多糖對(duì)IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液含10%血清條件下，白術(shù)多糖促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用較弱[7]，與本實(shí)驗(yàn)Fig 1和Tab 1結(jié)果相似，即在培養(yǎng)液含10%血清時(shí)，較難反映受試藥促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。對(duì)IEC-6細(xì)胞的研究表明，無(wú)血清培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液再加入5%血清，可通過增加細(xì)胞多胺和DNA合成等途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]，表明培養(yǎng)液所含血清是促進(jìn)細(xì)胞增殖的因素之一，因此，可能對(duì)受試藥的藥效結(jié)果產(chǎn)生干擾。本實(shí)驗(yàn)觀察不同實(shí)驗(yàn)條件(包括血清濃度)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為建立適合反映受試藥對(duì)細(xì)胞增殖影響的藥理模型提供參考。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清濃度較高時(shí)(5%～10%血清)，由于血清本身對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，可能會(huì)掩蓋受試藥(如EGF)促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥效；而培養(yǎng)液不含血清時(shí)(0%血清)，由于細(xì)胞增殖受到明顯抑制，也不利于較好體現(xiàn)受試藥促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥效；而血清濃度0.5%左右時(shí)，較有利于體現(xiàn)受試藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響。綜上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀建立IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)(增殖)藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膮⒖挤桨笧椋杭?xì)胞以含10%血清培養(yǎng)24 h，再無(wú)血清培養(yǎng)(即血清饑餓)20 h，然后加受試藥，并以含0.5%血清培養(yǎng)48～72 h，可觀察到受試藥對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)(增殖)影響的藥效。

目前，常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖方法如3H-TdR參入法、MTT法、WST法、CCK-8法等[9]，都是檢測(cè)特定時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖的情況，而RTCA采用電子阻抗技術(shù)檢測(cè)貼壁細(xì)胞黏附于E-plate板底部時(shí)電阻值的變化，并將變化的電阻值轉(zhuǎn)換為細(xì)胞指數(shù)，從而可在數(shù)十甚至數(shù)百小時(shí)中，動(dòng)態(tài)反映細(xì)胞生長(zhǎng)(增殖)等情況[3]，避免了僅進(jìn)行單個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察藥效的缺點(diǎn)，可以動(dòng)態(tài)觀察受試藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響，是細(xì)胞藥理實(shí)驗(yàn)的較好方法[10]。

本課題組在小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)建立了細(xì)胞遷移藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚11],以柱前衍生高效液相色譜法建立了檢測(cè)IEC-6細(xì)胞多胺含量的方法[12]，以流式細(xì)胞儀建立了IEC-6細(xì)胞膜電位檢測(cè)方法[13]，并觀察了益氣健脾中藥通過影響多胺信號(hào)通路而促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用[14]。本實(shí)驗(yàn)又以實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀建立了IEC-6細(xì)胞增殖藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，為更好地探討受試?如益氣健脾中藥)的藥理作用提供參考。

[致謝：本實(shí)驗(yàn)是在國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室“中藥藥理(消化)實(shí)驗(yàn)室”(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所建設(shè))和廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科“中醫(yī)內(nèi)科學(xué)”實(shí)驗(yàn)室(脾胃研究所是該學(xué)科組成部分)完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室各位同學(xué)和老師表示感謝！]

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中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘(2018年6期)2018-07-28 02:30:16

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鳳凰資訊報(bào)(2014年32期)2014-04-29 11:11:51

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中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)2018年2期

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