慢病毒介導穩(wěn)定高表達Cx32的Huh7細胞系建立及其對細胞增殖的影響

紀玉婷，楊 燕，鄭榮生，張吳瓊，劉 靜

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科，安徽 蚌埠 233004)

消化道腫瘤是人類面臨的重大難題，原發(fā)性肝癌是消化系統腫瘤的重要構成，其中約90%為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。HCC全球發(fā)病率及死亡率均居于前列，起病隱匿，初期癥狀不典型，一經發(fā)現多進展為中晚期，且增殖旺盛、侵襲遷移能力強，治療手段有限，這些導致其預后極差，治療現狀不容樂觀。因此，尋找HCC治療的新靶點具有重要的臨床價值及科學意義[1]。研究發(fā)現，HCC的發(fā)生發(fā)展和縫隙連接蛋白(connexin，Cx)功能異常有關[2]。Cx作為縫隙連接(gap junction，GJ)的結構蛋白，可以通過GJ依賴性和非GJ依賴性方式，對細胞的新陳代謝、內環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程起重要的調控作用[3]。Cx32 是人類肝臟中主要表達的Cx亞型蛋白，也是肝細胞GJ的主要組分[2]。一般認為Cx32為腫瘤抑制基因[4]，肝細胞的癌變過程伴隨有Cx32的減少或缺失[5]；而向HCC細胞過表達Cx32，腫瘤細胞生長、增殖和轉移能力呈負性調控[6]。但研究同時發(fā)現，Cx32在細胞質的異位蓄積也會促進HCC的進展[7]。此外，近年來也有資料顯示，Cx在某些情況下可能有利于腫瘤的進展[3]?？梢奀x32與HCC生物學行為之間的關系及分子機制尚需進一步闡明。本研究通過構建LV5-hCx32慢病毒載體，并將其導入人肝癌Huh7細胞系，建立穩(wěn)定過表達Cx32的Huh7細胞株，不僅為進一步研究Cx32及其組成的GJ在HCC中的生物學功能提供有力的工具，也將為基于Cx的靶點藥物研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料大腸桿菌TOP10、人胚腎293T細胞及人肝癌細胞Huh7由本實驗室保存；LV5-GFP及包裝質粒(pGag /Pol、pRev、pVSV-G)購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；NotⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA連接酶及DNA marker購于Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、普通DNA產物回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine 2000、Opti-MEM、DAPI及鈣黃綠素(calcein-AM)購于Invitrogen公司；Cx32、GAPDH引物由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；逆轉錄試劑盒及PCR所用酶、buffer、dNTP等均購于Promega公司；DMEM干粉、胎牛血清及胰蛋白酶購自Gibco公司；無水乙醇、異丙醇、溴化乙錠、Polybrene、嘌呤霉素、MTT、結晶紫及鼠抗人Cx32抗體購于Sigma公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、HRP及FITC標記的二抗購自Amersham公司；BSA蛋白定量試劑盒及丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺均為Bio-Rad公司產品；ECL-plus化學發(fā)光試劑盒購自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1目的基因片段的獲取和擴增 參照GenBank中人Cx32 mRNA的CDS全長序列(NM_001097642.2)，利用全基因合成方法獲得基因片段，由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，并在目的基因上、下游引物分別加上NotⅠ和Bam HⅠ及保護堿基，以此為模板進行PCR擴增。反應條件為：95℃ 預變性3 min，94℃ 變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收。

1.2.2LV5-GFP-hCx32重組質粒構建擴增和鑒定 使用NotⅠ和Bam HⅠ分別雙酶切目的基因hCx32及LV5空載體，DNA連接酶在連接緩沖液中22℃連接2 h。連接后的重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10，收集轉化后的菌液，涂布在含50 mg·L-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取陽性菌落，擴增進行質粒酶切鑒定，小量抽提質粒，送蘇州吉碼基因股份有限公司測序鑒定，獲取重組質粒LV5-hCx32。

1.2.3重組慢病毒及陰性對照慢病毒的包裝和濃縮 轉染前24 h，將生長狀態(tài)良好的293T細胞胰酶消化，重懸接種于15 cm培養(yǎng)皿中，待細胞密度達到50%時，將重組慢病毒質粒LV5-hCx32和包裝質粒經Lipofectamine 2000共轉染至293T細胞中，用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，換成含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。72 h后收集病毒上清液，4℃、4 000 r·min-1離心4 min；低速離心后，用0.45 μm過濾器過濾，濾液經4℃、20 000 r·min-1超速離心2 h，收集濃縮液-80℃保存。重組慢病毒顆粒命名為LV5-GFP-hCx32，用上述相同方法獲得陰性對照LV5-NC慢病毒顆粒。

1.2.4病毒滴度測定 293T細胞培養(yǎng)至80%～90%融合，胰酶消化重懸細胞，按每孔0.5×105～1×105的密度接種至96孔板，每孔體積100 μL，培養(yǎng)24 h。取慢病毒原液10～20 μL，用10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液10倍稀釋3～5個梯度，吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入500 μL稀釋的病毒液，同時設立空白對照組，于37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h；吸棄96 孔板中的稀釋病毒液，每孔加入 1 mL 10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。通過熒光顯微鏡計數熒光細胞，結合稀釋倍數計算病毒滴度。

1.2.5重組慢病毒及陰性對照慢病毒轉染目的細胞Huh7 將對數生長期的Huh7細胞，以2.5×105/孔密度接種于24孔板，每孔0.5 mL，培養(yǎng)24 h后，細胞融合率達40%～60%，吸去細胞上清，加入培養(yǎng)基360 μL、40 μL不同梯度的病毒液(慢病毒原液達1011TU·L-1)及5 mg·L-1的Polybrene，每組3個復孔，以Lipofectamine 2000將質粒感染Huh7細胞，8～12 h后觀察細胞狀態(tài)，待細胞狀態(tài)與未感染組無明顯差異時，24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h 后熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，確認目的細胞的感染方法和感染參數。

1.2.6嘌呤霉素篩選濃度的確定 取對數生長期的Huh7細胞，胰酶消化，計數板計數，以1.5×105/孔密度接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，梯度加入嘌呤霉素，其濃度分別為0.25、0.5、0.75、1 mg·L-1，同時設置Blank孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，篩選7 d 后，觀察每孔細胞死亡情況，將殺死全部細胞的最小濃度確定為穩(wěn)定轉染細胞株的篩選濃度。

1.2.7穩(wěn)定轉染細胞株Huh7的篩選及建立 Huh7細胞經脂質體瞬時轉染24 h后消化傳代，以10個/cm2接種至10 cm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，更換為含上述確定的篩選濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)液進行篩選。10～20 d后，LV5-hCx32質粒組和LV5-NC陰性對照質粒組均可見抗性克隆形成，未轉染組細胞全部死亡。以無菌克隆環(huán)挑取單細胞陽性克隆，消化傳代并擴大培養(yǎng)，2～3周后可獲得目標細胞系。

1.2.8qRT-PCR檢測Cx32 mRNA表達 按照操作說明，使用TRIzol提取細胞總RNA并測定RNA濃度。以1 μg RNA為模板，按照RT-PCR逆轉錄試劑盒操作說明合成cDNA，以2 μL cDNA為模板，進行PCR反應。反應條件：95℃ 3 min預變性， 95℃ 30 s變性， 62℃ 40 s退火，72℃ 30 s延伸，40個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。引物序列Cx32-F：5′-GCGTGAACCGGCATTCTA-3′，Cx32-R：5′-CCCTCAAGCCGTAGCATTT-3′ (產物大小295 bp)；GAPDH-F：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，GAPDH-R：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′(產物大小113 bp)。

1.2.9Western blot 檢測Cx32蛋白表達 實驗操作參照既往文獻[8]進行。每孔上樣蛋白量50 μg，Cx32一抗(1 ∶500)，置搖床4℃過夜；洗膜后加入HRP標記的羊抗小鼠二抗(1 ∶1 000)，室溫振搖2 h；洗膜后，用化學發(fā)光檢測試劑盒(ECL)化學發(fā)光自顯影，Quantity One 軟件分析，以β-actin為內參照，蛋白表達強度以Cx32蛋白表達灰度值與β-actin灰度值的比值計算。

1.2.10免疫熒光法檢測Cx32蛋白定位 實驗步驟參照本實驗室既往研究[8]。其中Cx32一抗工作濃度1 ∶200(以2% BSA稀釋)，FITC標記的二抗工作濃度1 ∶200(以2% BSA稀釋)。DAPI染核5 min，95%甘油封片劑封閉，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.11細胞接種熒光示蹤法測定Huh7細胞間GJ功能 使用本領域之前報道的方法測定GJ功能[8-9]。具體原理包括“供體細胞”和“受體細胞”，其中“供體細胞”經過熒光指示劑calcein-AM預處理30 min，該熒光染料能被胞內脂酶水解而形成發(fā)綠色熒光的calcein，calcein分子質量足夠小，能經GJ傳遞至鄰近細胞。以1 ∶200的比例將“供體細胞”接種到已生長融合的Huh7“受體細胞”上。培養(yǎng)4 h，待“供體細胞”與“受體細胞”間形成穩(wěn)定的GJ后，在倒置熒光顯微鏡下，計數一個“供體細胞”周圍含有綠色熒光的“受體細胞”的數目，作為GJ功能指標。

1.2.12MTT法檢測細胞增殖能力 將經過不同處理的Huh7細胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)相應時間，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，避光溫育4 h。終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀在490 nm 波長處測定OD值。

1.2.13克隆形成實驗 取對數生長期的各組細胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，計數，以500個/孔的密度接種于6孔板，置37℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)10～14 d。多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色10 min，清洗干燥后計數克隆，并進行拍照。實驗設置3 孔并重復3 次。

2 結果

2.1LV5-GFP-hCx32慢病毒載體的鑒定質粒酶切鑒定結果顯示，擴增出大小為852 bp 的Cx32 基因片段，和大小為9 337 bp 的LV5基因片段(Fig 1A)。測序結果證實，所獲得的表達質粒目的片段與預期完全相符(Fig 1B)。表明LV5-hCx32慢病毒表達載體構建成功。

2.2慢病毒的包裝和滴度測定將慢病毒包裝三質粒系統的DNA轉染293T細胞，培養(yǎng)72 h后，倒置顯微鏡下觀察，可見GFP綠色熒光，表明慢病毒包裝成功。根據病毒滴度計算公式，計算出濃縮后LV5-hCx32及LV5-NC慢病毒滴度約為3×1011TU·L-1，能夠滿足實驗對病毒液滴度的要求。

Fig 1 Identification of recombinant lentiviral plasmid

A: The result of enzyme digestion. 1: Marker; 2: Enzyme-digested product of the recombinant plasmid LV5-hCx32 (NotⅠ/ Bam HⅠ); B: Partial sequence diagram of LV5-GFP-hCx32 and the NCBI database matching results.

2.3LV5-GFP-hCx32載體及對照載體感染Huh7細胞的效率將成功包裝的重組慢病毒載體(LV5-GFP-hCx32)和陰性對照載體(LV5-GFP-NC)感染Huh7細胞，72 h通過熒光顯微鏡觀察細胞感染效率。預實驗結果表明，當慢病毒的滴度達到3×1011TU·L-1，按1 ∶10稀釋感染，細胞感染效率達到80%左右(Fig 2)，因此，選擇將病毒液以MOI 20感染靶細胞。

2.4LV5-GFP-hCx32載體及對照載體瞬時感染Huh7細胞后Cx32的表達qRT-PCR結果顯示，與未轉染組相比， LV5-NC瞬時感染組Cx32 mRNA表達無明顯變化，但LV5-hCx32瞬時感染組Cx32 mRNA表達是其214.4 倍(Fig 3A)。同時，Western blot檢測結果也顯示，LV5-NC空質粒和LV5-hCx32質粒瞬時轉染組的細胞內均有Cx32 蛋白表達，但LV5-hCx32質粒轉染組Cx32蛋白表達明顯高于空質粒轉染組，約為空質粒組的13.3倍(Fig 3B)。

2.5顯微鏡下觀察確定嘌呤霉素篩選藥物濃度經不同濃度嘌呤霉素篩選7 d 后，在顯微鏡下觀察細胞的死亡情況，發(fā)現0.75 mg·L-1以及更高濃度的嘌呤霉素可將細胞全部殺死，最終確定嘌呤霉素篩選濃度為0.75 mg·L-1(Fig 4)。

2.6穩(wěn)定過表達hCx32的Huh7細胞系的建立向感染LV5-NC和LV5-hCx32慢病毒的Huh7細胞中加入0.75 mg·L-1的嘌呤霉素進行不斷篩選，陽性細胞克隆在20余次傳代后全部穩(wěn)定存活，GFP表達情況如Fig 5所示。

Fig 2 Transient transfection of Huh7 cells with LV5-GFP-hCx32recombinant lentiviral plasmid (×100)

A: Transfection of 3×1011TU·L-1lentivirus diluted at 1 ∶10 with 72 h; B: Transfection of 3×1011TU·L-1lentivirus diluted at 1 ∶50 with 72 h.

Fig 3 Expression of Cx32 in Huh7 cells after transienttransfection with LV5-hCx32 and LV5-NC plasmid (n=3)

A: qRT-PCR was used to detect the mRNA level of Cx32; B: Western blot was used to measure the protein expression of Cx32.**P<0.01vscontrol or LV5-NC.

2.7穩(wěn)定細胞株中Cx32的表達、定位及GJ形成qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，與LV5-NC穩(wěn)定轉染Huh7對照細胞相比，LV5-hCx32穩(wěn)定轉染細胞Cx32 mRNA和蛋白表達水平均明顯增加，分別是對照組的72.5倍和9.3倍(Fig 6A、6B)。免疫熒光實驗進一步表明，該細胞內Cx32彌散分布于細胞質中，僅有少量呈細顆粒狀定位于細胞膜上；LV5-hCx32組細胞Cx32熒光量明顯增強，且增加的Cx32有定位于細胞膜上的潛力(Fig 6C)，形成GJ的能力增強(Fig 6D)，表明穩(wěn)定高表達hCx32的Huh7細胞模型構建成功。

Fig 4 The Huh7 cells after selection with differentconcentrations of puromycin for 7 days (×100)

A: Puromycin 0.25 mg·L-1; B: Puromycin 0.5 mg·L-1; C: Puromycin 0.75 mg·L-1; D: Puromycin 1.0 mg·L-1

Fig 5 Stable transfection of Huh7 cells with LV5-GFP-hCx32and LV5-GFP-NC recombinant lentiviral plasmids (×100)

2.8穩(wěn)定高表達Cx32對Huh7細胞增殖的影響MTT結果表明，LV5-NC對照組與空白組細胞的增殖能力在各時間段均無明顯差異，而LV5-hCx32組細胞的增殖能力明顯減弱(Fig 7A)。同樣的結果在克隆形成實驗中也得到證實(Fig 7B)。表明穩(wěn)定高表達Cx32對肝癌Huh7細胞的增殖能力有抑制作用。

3 討論

惡性腫瘤是威脅人類健康的頭號殺手，隨著腫瘤研究的不斷深入，人們開始從分子生物學角度去審視其發(fā)生機制?；虻耐蛔儭⒔M織細胞的逆分化、免疫監(jiān)視的缺失等導致細胞出現失控性、異質性增長，進而引發(fā)一系列惡果。靶向治療則是在細胞分子水平，針對已經明確的致癌位點，設計的識別和攻擊腫瘤細胞的新興治療手段，其高效、特異、低毒等特點徹底顛覆了傳統的治療模式，開啟了腫瘤治療的新篇章。HCC是一種具有高侵襲轉移能力的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內呈逐年上升趨勢。索拉非尼作為晚期HCC的一線治療方案并沒有取得令人滿意的療效[10]，而其他靶向藥物在臨床試驗階段均遭遇失敗[11]。因此，探索HCC發(fā)生發(fā)展機制，尋找HCC治療的新靶點迫在眉睫。

Fig 6 Cx32 expression, localization and GJ statusin Huh7 cells after stable transfection withLV5-hCx32 and LV5-NC plasmid (n=3)

A: qRT-PCR was used to detect the mRNA level of Cx32; B: Western blot was used to measure the protein expression of Cx32; C: Immunofluorescent staining showed diffuse cytoplasmic but only a partial membranous Cx32 expression (marked by red arrow) in Huh7 cells, and more membranous localization of Cx32 was observed by Cx32 transfection (marked by red arrow) (×400); D: Fluorescence images showed an enhanced dye coupling (GJ activity) between adjacent Huh7 cells (×200).*P<0.05,**P<0.01vsLV5-NC.

Fig 7 Effect of overexpressed Cx32 oncell proliferation in Huh7 cells (n=3)

A: MTT assay was used to detect the absorbance at 490 nm; B: Colony formation assay was used to determine the cellular proliferation capacity.**P<0.01vscontrol or LV5-NC.

GJ是位于兩個相鄰細胞之間的一種蛋白質連接通道，通過直接介導細胞之間的物質轉運及信號轉導，參與調節(jié)細胞的生長、分化及凋亡。Cx32是肝臟GJ的主要組成蛋白[2]，與其他Cx(如Cx26、Cx43等)協同完成肝細胞間一系列生理過程。肝臟中Cx結構功能的變化，可能會導致GJ通道通透性和對通透物質選擇性的改變，進而影響細胞間的物質交換和信號傳遞，最終導致細胞功能異常。如Cx32基因缺陷小鼠易受到物理輻射及化學毒物損傷，引發(fā)肝臟惡性腫瘤的發(fā)生[12]；正常肝細胞向HCC的演變過程中伴隨Cx32表達量的下調及GJ功能的失調[5]；而體外向HCC細胞轉染Cx32上調GJ則能抑制癌細胞增殖和克隆形成[6]。Cx32參與調控HCC機制可能為有功能的Cx32表達數量減少，不能形成有效的GJ通道，導致惡性啟動細胞失去周圍正常細胞對其的調控，細胞失控性增長，引發(fā)腫瘤并不斷進展。然而，Cx及其構成的GJ作為腫瘤抑制基因的傳統理念受到了挑戰(zhàn)[3]。有研究發(fā)現，Cx通過增加血管侵襲力,促進乳腺癌及惡性黑色素瘤腦轉移的發(fā)生[13]；其在腫瘤患者淋巴結轉移灶中高表達，并與不良預后有關[14-15]。研究還顯示，Cx32在HCC細胞質中的異位蓄積能夠加強腫瘤細胞自我更新，從而加劇其惡性生物學行為[7]。由此可見，在Cx32與HCC紛雜的關系網絡中，二者之間的聯系以及關聯機制尚需進一步研究。

GJ特異性工具藥物的缺乏，是阻礙當前GJ研究及其與HCC治療相關性認識的主要障礙。因此，建立一種可特異性調控Cx32及其組成GJ的HCC細胞模型，對于闡明Cx32在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機制尤為必要。慢病毒以其高效地轉染各個分裂時相細胞、特異地調控目的基因表達水平等特點，被廣泛應用于基因功能鑒定及分子生物學研究領域，并在腦、肺、肝及造血干細胞等疾病的潛在靶點研究中扮演重要的角色，已成為人類基因治療的有效工具。本研究將PCR擴增所得Cx32基因片段重組至LV5-GFP載體，經過酶切、連接及測序驗證，轉染293T細胞進行病毒包裝，成功獲得病毒滴度為3×1011TU·L-1的重組慢病毒LV5-GFP-hCx32，感染Huh7細胞，并經嘌呤霉素篩選出細胞陽性克隆，分子生物學方法證實該細胞亞系Cx32穩(wěn)定高表達，高表達的Cx32大部分分布于細胞質，小部分定位于細胞膜，這些定位于細胞膜的Cx32蛋白有形成GJ的能力。Cx32特異性過表達對Huh7細胞生長及增殖能力有明顯的抑制作用，與既往的報道結果較為一致[6]，其機制不排除GJ依賴性和非GJ依賴性的綜合作用。研究結果綜合表明穩(wěn)定過表達Cx32的人肝癌Huh7細胞系被成功構建。

綜上所述，充分理解Cx32及其組成GJ參與HCC的分子機制是未來HCC靶向藥物研發(fā)的新視角，建立穩(wěn)定調控Cx32的細胞模型是研究最為理想的手段之一。本研究通過LV5慢病毒表達載體，成功構建了穩(wěn)定過表達Cx32的Huh7細胞模型，且過表達的Cx32蛋白可以明顯抑制Huh7細胞的增殖能力。該工具細胞將為后續(xù)揭示Cx32在HCC中的生物學效應提供有力的實驗手段，也為發(fā)展以GJ為靶點的新型藥物提供線索和依據。

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