楊春艷,范文翔,歐學(xué)蘭,袁斌
(川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所·川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川南充637000)
骨肉瘤是兒童和青少年常見的骨惡性腫瘤,具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移早的特點(diǎn)。雖然目前采用聯(lián)合化療及手術(shù)綜合治療后患者的5年生存率提高到60%~70%,但仍有患者效果不佳,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍達(dá)30%~40%[1]??晒┻x擇的臨床化療藥物有限,而且大多數(shù)都存在耐藥性。柴胡是傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根[2]。其最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,味苦、辛,性微寒,歸肝、膽經(jīng),具有退熱解表、疏肝解郁、升舉清氣的功效,由柴胡組成的經(jīng)典古方有數(shù)百首[3]。其主要化學(xué)成分和生物活性成分為柴胡皂苷(saikosaponins,SS)。柴胡皂苷屬環(huán)氧醚型五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物,對(duì)胃癌、肺癌、前列腺癌及肝癌具有抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等抗腫瘤作用[4-7],而柴胡皂苷應(yīng)用于治療骨肉瘤的研究報(bào)道極少。本研究中通過研究柴胡皂苷單體柴胡皂苷D(SS-d)對(duì)人骨肉瘤143B細(xì)胞增殖的影響,為柴胡皂苷單體今后用于骨肉瘤的臨床治療提供參考。
儀器:熒光CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);Spectramax 190型酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司);Micro17R型高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。
細(xì)胞株及試藥:143B細(xì)胞株(中橋新舟生物科技有限公司);柴胡皂苷D(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所);注射用鹽酸多柔比星(海正輝瑞制藥有限公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司);骨鈣素(OCN)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2.1 主要試劑配置及分組
柴胡皂苷D濃度配置:取柴胡皂苷D 13 mg,分別加入166 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解,充分混勻,制成終濃度為100 mmol/L的母藥溶液,4℃保存?zhèn)溆?,使用時(shí)加入DMEM培養(yǎng)基,將其稀釋至相應(yīng)濃度,備用。
分組:設(shè)置陰性對(duì)照組(A組,加入同體積培養(yǎng)液),陽(yáng)性對(duì)照組(B組,加10 μg/mL多柔比星),藥物組(C1,C2,C3,C4,C5,C6組,分別加6.25,12.50,25.00,50.00,100.00,200.00 μmol/L柴胡皂苷D)。
1.2.2 試驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng):143B細(xì)胞體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置5%CO2及37℃條件下二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性:用培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液濃度為1×104個(gè)/mL,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的143B細(xì)胞按1×105個(gè)/mL的密度接種在96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL;37℃培養(yǎng)24 h后加入柴胡皂苷D進(jìn)行干預(yù),分別設(shè)藥物組(C1,C2,C3,C4,C5,C6組,柴胡皂苷D梯度濃度為6.25,12.5,25,50,100,200 μmol/L)和對(duì)照組(A組,不加藥組),10 μg/mL多柔比星組(B組),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng),并于6,12,24,48,72 h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,繪制細(xì)胞增殖曲線。
143B細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察:在MTT試驗(yàn)中,加藥前后分別用倒置相差顯微鏡觀察不同濃度柴胡皂苷D(6.25,12.5,25,50,100,200 μmol/L)作用不同時(shí)間(6,12,24,48,72 h)后,各組培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況、形狀、密度及凋亡的細(xì)胞等。
樣本中AKP活力檢測(cè):將143B細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種于24孔板中,24 h后分別加入含不同藥物、不同濃度柴胡皂苷D培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),在6,12,24,48 h后吸取1 mL上清液置Ep管中,用離心機(jī)離心,吸取上清液保存。按AKP測(cè)試盒說明書進(jìn)行操作,步驟見表1。輕輕振搖檢測(cè)板,混勻孔板,在520 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度(OD)值。參照試劑說明書計(jì)算公式計(jì)算AKP活力。
樣本中OCN表達(dá)檢測(cè):按上述操作培養(yǎng)143B細(xì)胞,加柴胡皂苷D(終濃度為50 μmol/L),在藥物作用6,12,24,48 h后收集各孔中的培養(yǎng)液,以1 600 r/min的速率離心4 min,收集上清液,并封存于-80℃冰箱。參照骨鈣素酶聯(lián)免疫吸咐(ELISA)檢測(cè)試劑盒說明,設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和檢測(cè)樣品孔,按清洗、顯色、終止、檢測(cè)步驟操作,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程,計(jì)算樣品的濃度。
表1 AKP活力檢測(cè)步驟( L)
1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(表示,各組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
柴胡皂苷D作用143B細(xì)胞6 h后,細(xì)胞活力顯著降低,且隨著濃度的增加其生存率逐漸降低,隨著時(shí)間的增加其生存率有輕微下降。用藥6,12,24,72 h后,除6.25 μmol/L濃度組以外,其他藥物濃度組與對(duì)照組比較差異,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。48 h后,所有藥物濃度組間差距均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24,48 h后,陽(yáng)性對(duì)照藥多柔比星也有明顯抑制作用,與A組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。48 h后的25 μmol/L濃度組與72 h后的50 μmol/L濃度組細(xì)胞活性最低。詳見表2和圖1。
AKP是成骨分化的重要標(biāo)志之一。由表3可見,柴胡皂苷D對(duì)AKP的表達(dá)并無明顯影響,提示柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞的增殖抑制可能不是由促成骨分化作用造成的。而同一組藥物隨著時(shí)間的變化AKP活力改變也不明顯,這可能與藥物作用太強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞在6 h時(shí)就大量死亡有關(guān)。
表2 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞活力的影響(s,n=3)
表2 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞活力的影響(s,n=3)
注:與對(duì)照組相比, P<0.05。
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圖1 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞的抑制作用
由表4可見,柴胡皂苷D作用于143B細(xì)胞后,人骨鈣素含量均下降,50 μmol/L濃度的柴胡皂苷D作用24 h后人骨鈣素含量最低,為(0.59±0.002)ng/mL(P<0.05)。同一藥物組隨著時(shí)間的變化人骨鈣素含量差異較小,可能與細(xì)胞大量死亡有關(guān)。
柴胡皂苷D作用于143B細(xì)胞后,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),濃度的增大,細(xì)胞體積明顯變小,細(xì)胞核變小、固縮,全面皺縮,細(xì)胞膜破裂,由此可推斷出,143B細(xì)胞的凋亡可能由柴胡皂苷D改變細(xì)胞膜的通透性而引起。詳見圖2。
近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柴胡皂苷的藥理活性研究逐漸增多,已證實(shí)了柴胡皂苷在鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解熱、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝護(hù)腎,以及抗腫瘤等多方面具有良好的藥理學(xué)作用[8]。研究還表明,柴胡皂苷D是活性最強(qiáng)的單體,其發(fā)揮抗腫瘤作用[9]可能與以下幾種方式有關(guān):免疫調(diào)節(jié)作用;抑制腫瘤細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng);誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;抑制腫瘤轉(zhuǎn)移;抑制環(huán)氧合酶。柴胡皂苷是柴胡的毒性成分,具有肝毒性,不同產(chǎn)地、不同炮制方法、不同提取方法都對(duì)其毒性有影響,這主要是因?yàn)槠浜坎灰恢略斐傻?。相比于其他抗腫瘤藥物的高毒性、耐藥性,柴胡皂苷仍具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
表3 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞AKP活力的影響(s,金氏單位/100 mL,n=3)
表3 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞AKP活力的影響(s,金氏單位/100 mL,n=3)
注:與正常細(xì)胞組相比, P<0.05。
組別正常細(xì)胞組柴胡皂苷D(50 mol/L)組6 h 0.86±0.13 1.13±0.01 12 h 1.08±0.02 1.03±0.17 24 h 1.12±012 1.17±0.04 48 h 1.18±0.07 1.22±0.06
表4 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞人OCN含量的影響[s,ng/mL,n=3]
表4 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞人OCN含量的影響[s,ng/mL,n=3]
注:與正常細(xì)胞組相比, P<0.05。
組別正常細(xì)胞組柴胡皂苷D(50 mol/L)組6 h 0.99±0.03 0.73±0.71 12 h 1.34±0.08 0.61±0.08 24 h 1.23±0.001 0.59±0.002 48 h 1.20±0.07 0.66±0.21
圖2 加入柴胡皂苷D后的細(xì)胞形態(tài)變化
本研究中,采用不同濃度的柴胡皂苷D在體外作用于骨肉瘤143B細(xì)胞,通過MTT檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng),且呈一定的濃度相關(guān)性,但隨著時(shí)間的變化,作用改變不太明顯。顯微鏡下觀察柴胡皂苷D引起細(xì)胞形態(tài)明顯改變,細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂。這可能與李濤等[10]通過體外研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D的肝毒性并非簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而是柴胡皂苷D誘導(dǎo)了細(xì)胞膜通透性的改變,從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死這一結(jié)論有關(guān)。
皂苷類藥物還具有較強(qiáng)的溶血作用,這可能與143B細(xì)胞快速凋亡有關(guān)。為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)制,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率,考察柴胡皂苷D是否有促凋亡作用及有影響細(xì)胞周期的作用,若不具有促凋亡作用,則可進(jìn)一步進(jìn)行乳酸脫氫酶釋放率試驗(yàn)考察柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞膜的損傷作用。
試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)柴胡皂苷D作用后AKP的活力變化較小,而人骨鈣素的含量降低說明柴胡皂苷D抑制143B細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與促分化作用關(guān)系不大,與腫瘤細(xì)胞的凋亡和基因的調(diào)控關(guān)系很大。已有研究表明,脂肪酸合成酶(FAS)在骨肉瘤組織中過表達(dá),可以作為治療骨肉瘤疾病的新靶位[11]。有許多體內(nèi)和體外試驗(yàn)表明,F(xiàn)AS抑制劑能抑制腫瘤生長(zhǎng)[12-14]。后續(xù)試驗(yàn)可以檢測(cè)FAS基因的表達(dá)情況來驗(yàn)證其作用機(jī)制。有學(xué)者認(rèn)為,bcl-2/bax的比值是促使腫瘤細(xì)胞凋亡的重要原因,其中bcl-2是抑制凋亡的基因,bax是促進(jìn)凋亡的基因[15],可將其作為下一步考察的指標(biāo)。
綜上所述,雖然柴胡皂苷能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,但其主要作用機(jī)制還需要試驗(yàn)研究,其在體內(nèi)的活性情況也有待研究。隨著對(duì)皂苷抗癌作用研究的深入,有望在中醫(yī)理論指導(dǎo)下,利用現(xiàn)代分子藥理學(xué)及分子生物學(xué)提取篩選其有效成分,開發(fā)出新的抗腫瘤藥物。
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