丹參酮ⅡA對(duì)鼠新生血管的影響研究*

王科， 鐵明慧， 樊濤， 薛平， 張穎

610041 成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科

丹參(唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge根)是活血祛瘀類(lèi)的代表中藥, 《神農(nóng)本草經(jīng)疏》中既明確記載其有破癥除瘕的功效[1]。而丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液中的主要成分是從中藥丹參中提取的丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA, TSⅡA)的磺化產(chǎn)物，是丹參的主要活性成分之一。此前的一些基礎(chǔ)研究表明TSⅡA在體外能顯著抑制膽管癌細(xì)胞增殖，并能抑制EGFR基因、凋亡抑制基因Survivin的表達(dá)[2-3]，其通過(guò)對(duì)SAPK/JNK信號(hào)通路的影響、下調(diào)周期蛋白cyclin A和cyclin D2的表達(dá)水平來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖[4-5]，可抑制人肺癌細(xì)胞株的增殖并影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)其凋亡[6]，也有報(bào)道TSⅡA在體外對(duì)子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、肝癌等細(xì)胞也具有顯著的抑制增殖，促進(jìn)凋亡的作用[7-15]。同時(shí)在部分臨床研究中，也發(fā)現(xiàn)了TSⅡA可以增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤的抑制作用，延緩腫瘤耐藥性，減輕化療的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量[16-20]。在臨床中，抗血管生成已是腫瘤治療的常用方法[21]，但是到目前為止，關(guān)于血管新生的丹參酮ⅡA影響因素研究文獻(xiàn)還很少，通過(guò)分析TSⅡA對(duì)微血管結(jié)構(gòu)與功能及其新生過(guò)程，有助于研究人員進(jìn)一步深入了解TSⅡA作用于血管的機(jī)理，同時(shí)也為腫瘤血管的正常化治療提供了理論參考。本文以體外培養(yǎng)方式建立并研究了大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)的血管生成模型[22-23]，探討了TSⅡA對(duì)新生微血管的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c 小鼠，雌雄各半，6～8周，20～18g,32只；SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，6～8周，(200±9)g，16只，飼養(yǎng)地點(diǎn)為四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物站，選擇普通飼料與自由飲水的喂養(yǎng)方式。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司)，批號(hào):H31022558，10mg/2ml。鼠內(nèi)皮抑素(ER)、Matrigel(BD Bioscience公司，批號(hào):356234)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (b-FGF)、牛血清白蛋白(BSA)及MCDB131培養(yǎng)基(Sigma公司，批號(hào):010899、E8279、AL133A)，肝素鈉(Anlresco公司，批號(hào):051219)，大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體(abcam，批號(hào):ab171207)，戊巴比妥鈉(Sigma ，批號(hào):P3761)。

1.1.3 儀器設(shè)備 顯微鏡(Nikon公司，型號(hào):MM-800LFA/LMAF)，酶標(biāo)儀(北京普朗有限公司，型號(hào):DNM-9602A)，成像系統(tǒng)(尼康，型號(hào):Nikon DS-U3)，冷凍離心機(jī)(珠江黑馬醫(yī)學(xué)有限公司，型號(hào):HemaMini4K)，超凈工作臺(tái)(SANYO ，Biological Safety Cabinets，ClassⅡ，NUAIR)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO ，MCO-15AC)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)器材：手術(shù)剪、眼科剪、眼科鑷、止血鉗(成都科華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥液配置 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，加生理鹽水8mL、18mL，稀釋至1mg/mL、0.5mg/mL，儲(chǔ)存于4℃的冰箱環(huán)境中，使用前需進(jìn)行搖勻。

1.2.2 小鼠各組用藥情況 采用隨機(jī)分配方式把BALB/c小鼠分為低劑量丹參酮ⅡA組(LG)、高劑量丹參酮ⅡA組(HG)、內(nèi)皮抑素組(ER)、陰性對(duì)照組(NS)共4組，其中每組數(shù)量為8只。種植Matrigel之前的3天時(shí)間，高、低劑量的丹參酮ⅡA組依次按照每天10mg/Kg、5mg/Kg腹腔注射，同時(shí)對(duì)陰性對(duì)照組采用腹腔注射方式注入同樣劑量的生理鹽水，并以5mg/Kg的濃度將內(nèi)皮抑素添加至Matrigel中，混合均勻之后將其注射到內(nèi)皮抑素組小鼠腹壁中心的皮下組織中。按照上述方式給藥持續(xù)8天時(shí)間。

1.2.3 植入Matrigel 將Matrigel置于4°C冰箱中進(jìn)行夜間熔化；對(duì)高壓滅菌處理后的EP管與移液器吸頭進(jìn)行4°C預(yù)冷。將配置得到的牛血清白蛋白濃度為100g/L的PBS溶液作為稀釋液，使b-FGF稀釋后的濃度達(dá)到2ug/L，肝素稀釋后的濃度達(dá)到1U/uL。在給藥到達(dá)3d時(shí)間時(shí)，將冰浴處理后的500uL Matrigel與50uL肝素、50uLb-FGF一起充分混合均勻?yàn)橹?；此外，按?mg/kg的濃度把內(nèi)皮抑素加到上述混合溶液中作為備用。之后，在冰浴條件下將以上得到的Matrigel采用皮下注射方式注入到各組小鼠的腹部中心部位，要求注射之前需左右晃動(dòng)針頭。5d時(shí)間后，采用后頸椎脫臼方式處死小鼠，并沿小鼠腹部中心線進(jìn)行解剖，為避免出血，需將基質(zhì)膠栓緩慢剝離，之后經(jīng)過(guò)PBS沖洗2至3次之后再拍照，各組分別選擇4塊Matrigel種植體作為血紅蛋白含量的測(cè)試樣品，同時(shí)在各組中分別選取4塊Matrigel種植體置于10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，準(zhǔn)備后續(xù)對(duì)免疫組織進(jìn)行化學(xué)染色。

1.2.4 測(cè)定血紅蛋白含量 將Matrigel種植體放置在-70°C溫度條件下進(jìn)行過(guò)夜脫水，之后在室溫條件下將其懸浮在0.5mL濃度為1g/L的TritonX-100溶液中保持2h，再將其轉(zhuǎn)移到4℃的冰箱中放置2h，取出并用吸管將其吹打?yàn)閼乙籂顟B(tài)，利用冷凍離心機(jī)在10 000rpm轉(zhuǎn)速下對(duì)其進(jìn)行離心處理10min，用酶標(biāo)分析儀測(cè)試上清液A405nm(血紅素的特征吸收波長(zhǎng))處的光吸收度A值，最后以鼠血紅蛋白標(biāo)曲線將測(cè)試數(shù)據(jù)換算為血紅蛋白的含量。

1.2.5 制備丹參酮ⅡA含藥血清 采用李儀奎教授提出的“通法”進(jìn)行含藥血清制備[17]。SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成丹參酮ⅡA組和生理鹽水組，丹參酮ⅡA組12只，生理鹽水組2只。其中丹參酮ⅡA組按5mg/kg腹腔注射，生理鹽水組則以等量生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。按照上述方式給藥持續(xù)5天時(shí)間，最后一次給藥之前需在不禁水條件下進(jìn)行12h禁食。最后一次給藥1h之后，以腹腔麻醉方式將4mg/100g戊巴比妥鈉注入大鼠體內(nèi)，將其置于超凈工作臺(tái)上從腹主動(dòng)脈處完成取血操作，將所得血液靜置凝固之后再進(jìn)行4 000rpm離心處理總共30min實(shí)現(xiàn)血清分離，在56°C下對(duì)其實(shí)施30min的水浴滅活處理，并經(jīng)0.22μm過(guò)濾除菌之后再分裝并將其儲(chǔ)存于-20°C環(huán)境中。

1.2.6 獲取與培養(yǎng)腹主動(dòng)脈環(huán) 將SD大鼠進(jìn)行頸椎脫臼方式處死，再將其浸泡在75%的乙醇中共15min，之后在超凈工作臺(tái)上剪取得到腹主動(dòng)脈，并在100mm培養(yǎng)皿內(nèi)采用PBS緩沖液對(duì)腹主動(dòng)脈總共清洗2次，將動(dòng)脈周邊纖維與膜組織去除后，把血管切為長(zhǎng)度為1mm至1.5mm的主動(dòng)脈環(huán)，再利用PBS緩沖液對(duì)其清洗2次，同時(shí)在MCDB131培養(yǎng)基中進(jìn)行漂洗2次。把動(dòng)脈環(huán)縱切面與培養(yǎng)孔底部保持平行的方式放入已經(jīng)鋪好matrigel基質(zhì)膠的50uL/well的48孔板中，再把熔化后的matrigel基質(zhì)膠加到各個(gè)孔中，每孔70uL，在5%CO2與37℃條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)2h孵育后，使基質(zhì)膠完全凝固。之后，加入100uL不同丹參酮ⅡA含藥血清的MCDB131培養(yǎng)基。根據(jù)不同濃度丹參酮ⅡA含藥血清分組得到：只含有MCDB131培養(yǎng)基的無(wú)血清組；添加了10%生理鹽水的大鼠血清對(duì)照組；80%丹參酮ⅡA含藥血清組；70%丹參酮ⅡA含藥血清組；60%丹參酮ⅡA含藥血清組；50%丹參酮ⅡA含藥血清組；40%丹參酮ⅡA含藥血清組；30%丹參酮ⅡA含藥血清組；20%丹參酮ⅡA含藥血清組；10%丹參酮ⅡA含藥血清組(將各濃度的丹參酮ⅡA含藥大鼠血清添加到MCDB131培養(yǎng)基內(nèi))。之后，再將細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)放入48孔板進(jìn)行培養(yǎng)，換液周期為2天。采用倒置顯微鏡對(duì)微血管的每天生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察分析，同時(shí)做好拍照記錄，為各組都設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，要求進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 測(cè)定新生微血管的出芽面積 要求由一個(gè)人單獨(dú)完成實(shí)驗(yàn)操作、測(cè)試、觀察與記錄。同時(shí)，在每天的相同時(shí)間對(duì)主動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行顯微鏡觀測(cè)，研究生長(zhǎng)狀況，對(duì)新生的微血管進(jìn)行拍照。當(dāng)生成的血管數(shù)量比較多之后，各孔分別從3個(gè)平面上對(duì)微血管進(jìn)行拍攝，對(duì)這些平面上的微血管面積進(jìn)行求平均值，將所得數(shù)據(jù)作為對(duì)應(yīng)孔微血管面積[24-25]，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到10天時(shí)停止拍攝，最后通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，計(jì)算得到每組新生微血管的出芽面積。

1.2.8 血管結(jié)構(gòu)分析與微血管計(jì)數(shù)(microvessel density count，MDC) 采用10%甲醛將來(lái)自小鼠體內(nèi)的Matrigel種植體進(jìn)行固定，3d后對(duì)其進(jìn)行石蠟包埋與切片處理，再進(jìn)行免疫組化染色或常規(guī)HE染色。以免疫組織化學(xué)法完成血管內(nèi)皮細(xì)胞 CD31分子的染色，再根據(jù)Weidner標(biāo)準(zhǔn)[26]對(duì)血管密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以100倍光鏡對(duì)切片進(jìn)行整體掃描觀察，查找高密度血管區(qū)域，之后在400倍的高倍鏡條件下對(duì)4個(gè)高密度血管區(qū)域進(jìn)行拍照記錄，各高倍鏡的視野面積都是150μm×100μm。以Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)高倍鏡條件下觀察到的微血管密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以計(jì)算得到的平均值作為最終的微血管數(shù)量。此外，利用顯微鏡對(duì)血管內(nèi)皮與周邊細(xì)胞進(jìn)行覆蓋狀態(tài)觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 肉眼觀察Matrigel種植體

在肉眼觀察下，內(nèi)皮抑素組的Matrigel種植體表現(xiàn)出最淡的顏色；丹參酮ⅡA組的小鼠Matrigel種植體顏色相比陰性對(duì)照組略微更淡，這有可能是因?yàn)檠軘?shù)量較低導(dǎo)致的現(xiàn)象，如圖1所示。

2.2 小鼠Matrigel種植體內(nèi)的血紅蛋白含量影響因素分析

將獲得的Matrigel種植體進(jìn)行血紅蛋白含量測(cè)試，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素組和高、低劑量丹參酮ⅡA組都表現(xiàn)出比陰性對(duì)照組更低的血紅蛋白含量(P<0.01)；高、低劑量丹參酮ⅡA組都比內(nèi)皮抑素組的血紅蛋白含量更高(P<0.01)；高劑量丹參酮ⅡA組比低劑量丹參酮ⅡA組具有更高的血紅蛋白含量(P <0.01)。(表1)。

2.3 小鼠Matrigel種植體免疫組織的化學(xué)染色情況

選擇CD31作為血管的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，以此實(shí)現(xiàn)血管新生內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組產(chǎn)生了較多的細(xì)胞數(shù)量，可以明顯看到被染成棕黃色的各個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞簇以及眾多內(nèi)皮細(xì)胞，也可以觀察到明顯的血管結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)皮細(xì)胞具有較深的著色效果；丹參酮ⅡA組比陰性對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量更少，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的著色更淡，血管結(jié)構(gòu)也相對(duì)更加模糊；高劑量丹參酮ⅡA組具有比低劑量丹參酮ⅡA組更多的細(xì)胞數(shù)；偶爾可以從內(nèi)皮抑素組中觀察到棕黃色的顆粒。如圖2所示。

表1 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠Matrigel種植體中血紅蛋白含量的影響

注：與正常組比較1)P<0.01；與內(nèi)皮抑素組比較2)P<0.01；與丹參酮ⅡA10mg·kg-1組比較3)P<0.01。

圖1 各組體內(nèi)Matrigel種植體顏色比較

圖2 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠 Matrigel種植體CD31蛋白表達(dá)的影響(免疫組化，x400)

2.4 對(duì)小鼠Matrigel種植體內(nèi)MDC的影響

與陰性對(duì)照組比較丹參酮ⅡA高劑量組的MDC降低(P<0.05)，內(nèi)皮抑素組與低劑量丹參酮ⅡA組MDC出現(xiàn)了明顯下降(P<0.01)；內(nèi)皮抑素組的MDC低于低劑量丹參酮ⅡA組(P<0.05)，同時(shí)也顯著低于高劑量丹參酮ⅡA組(P<0.01)；高劑量丹參酮ⅡA組MDC高于低劑量丹參酮ⅡA組(P<0.05)；以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和血紅蛋白的含量測(cè)試結(jié)果一致。結(jié)果如表2所示。

表2 丹參酮ⅡA 對(duì)小鼠Matrigel種植體內(nèi)MDC的影響

注：與正常組比較1)P<0.01；與正常組比較2)P<0.05；與內(nèi)皮抑素組比較3)P<0.05；與內(nèi)皮抑素組比較4)P<0.01；與丹參酮ⅡA 10 mg·kg-1組比較5)P<0.05。

2.5 主動(dòng)脈環(huán)的新生微血管形態(tài)學(xué)分析

除了無(wú)血清組以外，對(duì)其它各組培養(yǎng)達(dá)到3-5d時(shí)，都可以在動(dòng)脈環(huán)周邊觀察到有眾多內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖與遷移現(xiàn)象，同時(shí)大鼠主動(dòng)脈環(huán)也逐漸進(jìn)入出芽狀態(tài)。這些出芽細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形，以放射形態(tài)從血管環(huán)外膜朝各個(gè)方向進(jìn)行延伸, 最終形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到10天時(shí)，部分新生微血管開(kāi)始出現(xiàn)萎縮，結(jié)構(gòu)凌亂模糊。結(jié)果如圖3所示。

2.6 主動(dòng)脈環(huán)新生微血管出芽面積

在培養(yǎng)到達(dá)第10天時(shí)拍攝停止，以Image Pro分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)試，統(tǒng)計(jì)每組的新生微血管總出芽面積。與對(duì)照組比較10%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積減少(P<0.05)，20%、30%、40%、50%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積均明顯減少(P<0.01)；70%和 80%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積較對(duì)照組高(P<0.01)，60%丹參酮ⅡA含藥血清組相比于對(duì)照組微血管出芽面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10%、20%、30%、40%、50%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管的出芽面積不同組進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，和60%、70%和 80%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積比較均明顯減少(P<0.05)。但與10%丹參酮ⅡA含藥血清比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。60%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積較較70%和 80%丹參酮ⅡA含藥血清組低(P<0.01)，70%和 80%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果如圖4所示。

圖3 不同濃度血清培養(yǎng)10天后大鼠主動(dòng)脈環(huán)微血管出芽情況(x100)

A.無(wú)血清組；B.對(duì)照組；C.80%丹參酮ⅡA含藥血清組；D.70%丹參酮ⅡA含藥血清組；E.60%丹參酮ⅡA含藥血清組；F.50%丹參酮ⅡA含藥血清組；G.40%丹參酮ⅡA含藥血清組；H.30%丹參酮ⅡA含藥血清組；I.20%丹參酮ⅡA含藥血清組；J.10%丹參酮ⅡA含藥血清組。

圖4 大鼠主動(dòng)脈環(huán)新生微血管出芽面積(像素)

0為對(duì)照組,n=8;a.50%丹參酮ⅡA含藥血清組以及40%、30%、20%、10%丹參酮ⅡA含藥血清組vs.對(duì)照組，P<0.05；b.80%丹參酮ⅡA含藥血清組、70%丹參酮ⅡA含藥血清組vs.對(duì)照組，P<0.01。

2.7 主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)物免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)物免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，80%、70%丹含藥血清組具有更多的細(xì)胞數(shù)量，可以發(fā)現(xiàn)存在比較多的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞，顏色較深區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量更多，同時(shí)血管結(jié)構(gòu)也更加密集；隨著丹參酮ⅡA含藥血清濃度降低，細(xì)胞數(shù)量減少，且血管結(jié)構(gòu)清晰、內(nèi)皮細(xì)胞著色變淺，在丹參酮ⅡA含藥血清濃度為50%時(shí)，血管環(huán)周?chē)鷥H偶見(jiàn)少量棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇；隨著丹參酮ⅡA含藥血清濃度再次降低(<50%)，血管環(huán)周?chē)募?xì)胞數(shù)量逐漸增多，微血管分支逐漸增多，結(jié)構(gòu)紊亂。該結(jié)果與微血管出芽情況一致。(圖5)。

圖5 不同濃度血清培養(yǎng)10天后大鼠主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)物IHC染色結(jié)果(×400)

A.無(wú)血清組；B.對(duì)照組；C.80%丹參酮ⅡA含藥血清組；D.70%丹參酮ⅡA含藥血清組；E.60%丹參酮ⅡA含藥血清組；F.50%丹參酮ⅡA含藥血清組；G.40%丹參酮ⅡA含藥血清組；H.30%丹參酮ⅡA含藥血清組；I.20%丹參酮ⅡA含藥血清組；J.10%丹參酮ⅡA含藥血清組。

2.8 動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)新生微血管密度

與對(duì)照組比較60%丹參酮ⅡA含藥血清組組間微血管密度沒(méi)有差異(P>0.05)；10%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管密度較對(duì)照組減少(P<0.05)；20%、30%、40%、50%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管密度均明顯降低(P<0.01)，該結(jié)果與新生微血管出芽面積一致；當(dāng)?shù)⑼駻含藥血清增加至70%、80%時(shí)，微血管密度較對(duì)照組增多(P<0.05)。因此，當(dāng)?shù)⑼駻的含藥血清濃度低于50%的條件下，其濃度上升后，會(huì)對(duì)血管環(huán)新生血管產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制效果，導(dǎo)致血管環(huán)的新生微血管出現(xiàn)密度下降現(xiàn)象，尤其是當(dāng)含藥血清濃度達(dá)到50%時(shí)和對(duì)照組對(duì)比具有明顯的差異性；在丹參酮ⅡA含藥血清達(dá)到50%以上的濃度條件下，當(dāng)濃度進(jìn)一步增大后，其對(duì)新生微血管的抑制效果會(huì)降低，轉(zhuǎn)為促進(jìn)作用，相關(guān)性分析r=0.549，P<0.05。(表3，圖6)。

表3 主動(dòng)脈環(huán)新生微血管密度比較(血管數(shù)/HP)

注：1)10%丹參酮ⅡA含藥血清組vs.對(duì)照組(P<0.05)；2)20%丹參酮ⅡA含藥血清組、30%丹參酮ⅡA含藥血清組、40%丹參酮ⅡA含藥血清組、50%丹參酮ⅡA含藥血清組vs.對(duì)照組，P<0.01；3)70%丹參酮ⅡA含藥血清組、80%丹參酮ⅡA含藥血清組vs.對(duì)照組，P<0.01。

圖6 大鼠主動(dòng)脈環(huán)新生微血管密度(血管數(shù)·H-1)

3 討 論

中醫(yī)對(duì)于腫瘤的病因病機(jī)學(xué)說(shuō)很多，比如氣血虧虛、腎精不足、氣血瘀滯，對(duì)應(yīng)著補(bǔ)益氣血、補(bǔ)腎填精、活血化瘀等治療法則?；钛鲆彩且环N應(yīng)用較為普遍的臨床腫瘤中醫(yī)治療原則。文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，活血化瘀藥物能夠?qū)δ[瘤血管的新生與生成起到抑制效果[27-30]。但另一方面，活血化瘀藥物是否會(huì)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移、進(jìn)展仍有爭(zhēng)議[31]。筆者認(rèn)為，結(jié)合中醫(yī)理論和此前的很多基礎(chǔ)研究，這樣的矛盾并不應(yīng)該簡(jiǎn)單的理解為負(fù)面效應(yīng)，而是理解為活血化瘀藥物在抗腫瘤中具有雙向調(diào)節(jié)作用?？梢詫?duì)非腫瘤情況下的瘀阻血絡(luò)發(fā)揮“疏通”效果，同時(shí)對(duì)腫瘤血絡(luò)起到“抑制”效果[32]。類(lèi)似的藥物例如白芍總甙，其在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中也是發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[33-34]。所謂調(diào)節(jié)，既不是促進(jìn)，也不是抑制，而是一種雙向作用，體現(xiàn)出中醫(yī)理論中對(duì)立統(tǒng)一的觀念。

丹參是活血化瘀代表藥物，20世紀(jì)上半葉，日本學(xué)者首次從丹參中分離得到脂溶性有效成分丹參酮ⅡA，后80年代，錢(qián)明堃等對(duì)丹參酮ⅡA進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其能夠起到較好的心血管藥理效果，不過(guò)腸道吸收方式的效率較低，無(wú)法發(fā)揮快速的臨床作用，因此首次提出了以磺化反應(yīng)半合成方式得到了丹參酮ⅡA磺酸鈉。本實(shí)驗(yàn)中使用的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液是即是其針劑，成分單一，利于分析。其在缺血性腦卒中，慢性心力衰竭，急性心肌梗死，腎血管改變等[35-38]多種疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療中應(yīng)用廣泛，作用確切，甚至已被列入專(zhuān)家共識(shí)[39]。結(jié)合中醫(yī)“異病同治”的理論，我們將其運(yùn)用到腫瘤疾病的治療中。

Matrigel[40-41]主要成分為層粘連蛋白，Ⅳ型膠原蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白，纖維原生長(zhǎng)因子，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑和其他生長(zhǎng)因子，其能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，能夠有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和分化，在體內(nèi)內(nèi)皮血管生成系統(tǒng)研究中使用廣泛。內(nèi)皮抑素是1997年O’Reilly 等從培養(yǎng)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞瘤( EOMA)上清中分離純化的一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，是目前作用最強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)效果最好的腫瘤血管生成抑制劑[42-43]，近年來(lái)倍受關(guān)注，目前在美國(guó)已進(jìn)行Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)，并有可能成為新一代抗腫瘤藥物。我們將其選為對(duì)照藥物，就是希望比較其與丹參酮ⅡA的效果。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果沒(méi)有讓我們失望，通過(guò)對(duì)小鼠Matrigel種植體的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在血紅蛋白含量指標(biāo)方面，對(duì)比陰性對(duì)照組，丹參酮ⅡA高、低劑量組與內(nèi)皮抑素組都較低(P<0.01)；在此指標(biāo)上，相比內(nèi)皮抑素組，丹參酮ⅡA低、高劑量組都較高(P<0.01)；對(duì)比丹參酮ⅡA高劑量組，丹參酮ⅡA低劑量組較低(P<0.01)。對(duì)小鼠Matrigel種植體內(nèi)微血管計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)其結(jié)果和血紅蛋白含量檢測(cè)結(jié)果一致。也就是說(shuō)高、低劑量丹參酮ⅡA組都可以起到抑制Matrigel種植體血管生成的效果，且與濃度相關(guān)。

通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)中，無(wú)血清組沒(méi)有新生血管生成。與對(duì)照組比較，10%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積減少(P<0.05)，20%、30%、40%、50%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積均明顯減少(P<0.01)；70%和 80%丹參酮ⅡA含藥血清組微血管出芽面積較對(duì)照組高(P<0.01)，在微血管出芽面積指標(biāo)上，60%丹參酮ⅡA含藥血清組同對(duì)照組不存在明顯區(qū)別(P>0.05)。對(duì)培養(yǎng)物新生微血管計(jì)數(shù)結(jié)果與微血管出芽面積一致。在丹參酮ⅡA含藥血清濃度不大于50%時(shí)，此藥物抑制血管環(huán)新生血管水平會(huì)隨著自身濃度的提高而增強(qiáng)，同時(shí)會(huì)逐漸降低血管環(huán)新生微血管密度，尤其在含藥血清濃度等于50%時(shí)，對(duì)比對(duì)照組，存在顯著區(qū)別，經(jīng)相關(guān)性分析(r=-0.563，且P<0.01)；在丹參酮ⅡA含藥血清濃度不大于50%時(shí)，在藥物濃度加大下，會(huì)慢慢降低自身抑制血管環(huán)新生微血管功能，轉(zhuǎn)為促進(jìn)作用，相關(guān)性分析(r=0.549，P<0.05)。即丹參酮ⅡA對(duì)血管環(huán)新生血管具有抑制和促進(jìn)雙向的作用，其作用趨勢(shì)與丹參酮ⅡA亦呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。

當(dāng)然，由于條件與經(jīng)費(fèi)有限，如果使用激光共聚焦顯微鏡、活體熒光顯微鏡、多光子激光掃描顯微鏡等動(dòng)態(tài)觀察，在觀察結(jié)構(gòu)變化同時(shí)了解藥物作用的時(shí)間窗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將更精確，而且更有利于指導(dǎo)其后期在臨床中與現(xiàn)有治療技術(shù)的結(jié)合。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析丹參酮ⅡA對(duì)血管功能及其結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步研究丹參酮ⅡA對(duì)血管作用機(jī)理以及實(shí)現(xiàn)腫瘤血管正?；峁┝死碚搮⒖?。此外，本文還探討了活血化瘀藥物的治療機(jī)理，可以為臨床用藥提供一定的參考。

作者聲明：本文第一作者對(duì)于研究和撰寫(xiě)的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無(wú)相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測(cè)；

同行評(píng)議：經(jīng)同行專(zhuān)家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

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