Roche定量試劑和國(guó)產(chǎn)PCR試劑檢測(cè)HBV—DNA的比較分析

周美英+高國(guó)生+胡愛(ài)榮

[摘要] 目的 探討Roche定量試劑和國(guó)產(chǎn)PCR試劑檢測(cè)慢性HBV感染者血清HBV-DNA的差異。 方法 收集慢性HBV感染患者366例，包括慢性乙型肝炎患者247例，乙肝肝硬化失代償患者72例，乙肝相關(guān)性肝癌患者28例，乙型慢加急性肝衰竭患者19例；采用Roche定量試劑（試劑A）和和國(guó)產(chǎn)PCR試劑（試劑B）檢測(cè)患者血清HBV-DNA，比較檢測(cè)結(jié)果的差異、相關(guān)性及影響因素。 結(jié)果 試劑B 124例（33.88%）低于檢測(cè)下限而試劑A高于檢測(cè)下限（包括24例超過(guò)1.00×103 IU/mL，考慮試劑B為假陰性）；試劑A的陽(yáng)性率（70.49%）顯著高于試劑B（36.61%）（P<0.01）。試劑A的HBV-DNA檢測(cè)均值高于試劑B（P<0.05），HBeAg滴度低者、終末期患者更容易出現(xiàn)COBAS系統(tǒng)的血清HBV-DNA檢測(cè)值高于國(guó)產(chǎn)試劑的情況。Spearman相關(guān)分析顯示，兩種試劑在1.00×103 IU/mL

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；COBAS Taqman系統(tǒng)；熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）34-0114-04

Comparative analysis of Roche quantitative reagent and domestic PCR reagent for detection of HBV-DNA

ZHOU Meiying1 GAO Guosheng2 HU Airong3

1.Center Laboratory，Zhejiang Taizhou Hospital，Taizhou 317000，China；2.Department of Clinical Laboratory，Ningbo City Second Hospital，Ningbo 315010，China；3.Department of Liver Diseases，Ningbo City Second Hospital，Ningbo 315010，China

[Abstract] Objective To investigate the difference in detecting serum HBV-DNA of chronic HBV infection patients between Roche quantitative reagent and domestic PCR reagent. Methods 366 patients with chronic HBV infection were collected， including 247 patients with chronic hepatitis B， 72 patients with decompensated liver cirrhosis， 28 patients with hepatitis B-related hepatocellular carcinoma and 19 patients with acute-on-chronic liver failure. Roche quantitative reagent（reagent A）and domestic PCR reagent（reagent B）were used to detect the serum HBV-DNA. And the difference of the detection results， the correlation and influencing factors between the two reagents were compared. Results There were 124 cases（33.88%） which were below the detection limit detected by reagent B and above the detection limit detected by reagent A， including 24 cases more than 1.00×103 IU/mL， considering reagent B as false negative. The positive rate of reagent A（70.49%） was significantly higher than that of reagent B（36.61%）（P<0.01）. The detection mean values of HBV-DNA by reagent A was higher than those of reagent B（P<0.05）. The patients with lower HBeAg titers， end-stage were more prone to appear the situation that the serum HBV-DNA of the COBAS system was higher than that of the domestic reagent. Spearman correlation analysis showed that the correlation was better when two reagents were in the 1.00×103 IU/mL

[Key words] Hepatitis B virus； COBAS Taqman system； Fluorescence quantitative PCR

我國(guó)是乙型肝炎病毒（HBV）感染的高流行地區(qū)，其中1～59歲普通人群乙肝表面抗原的攜帶率約為7.18%[1]。HBV-DNA的檢測(cè)對(duì)于HBV相關(guān)疾病的診斷與治療均十分重要[2]，目前國(guó)內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)多采用國(guó)產(chǎn)PCR試劑，而國(guó)際“金標(biāo)準(zhǔn)”是Roche公司的COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)試劑盒，這兩種試劑在敏感性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性范圍等方面均存在差異[3-4]。在實(shí)際臨床工作中，對(duì)于如何評(píng)價(jià)、選擇和使用HBV-DNA檢測(cè)仍存在一些理解不到位的地方，由此可能導(dǎo)致誤診、誤治。本文從多個(gè)角度對(duì)國(guó)產(chǎn)PCR試劑和Roche定量試劑檢測(cè)HBV-DNA作比較分析，為臨床合理、正確地應(yīng)用相應(yīng)試劑檢測(cè)HBV-DNA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年12月～2015年10月在本院肝病中心就診的慢性HBV感染患者366例，包括247例慢性乙型肝炎（CHB）患者，72例乙肝肝硬化失代償患者，28例乙肝相關(guān)性肝癌患者，19例乙型慢加急性肝衰竭患者，后三者歸為終末期肝病。其中男261例，女105例；年齡5～81歲，平均（43.94±12.96）歲，所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》（2015版）[5]。HBV感染患者均為單一HBV感染，排除其他肝炎病毒或原因引起的肝病。

1.2 方法

所有患者標(biāo)本同時(shí)用兩種試劑（或方法）檢測(cè)HBV-DNA，試劑A采用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48系統(tǒng)的配套試劑；試劑B由國(guó)內(nèi)某公司生產(chǎn)的熒光定量PCR試劑（為避免商業(yè)利益糾紛，以試劑B替代其名稱），檢測(cè)儀器采用美國(guó)ABI 7500型熒光定量PCR儀。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分為兩組，A組為試劑A的檢測(cè)值高于試劑B，B組為B的檢測(cè)值高于試劑A。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料采用M（Q25，Q75）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)分析兩種試劑（或方法）檢測(cè)HBV-DNA的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 兩種試劑的基本特征比較

試劑A的HBV-DNA檢測(cè)值范圍20.9～>1.70×108 IU/mL，試劑B的HBV-DNA檢測(cè)值范圍617.00～5.62×108 IU/mL。其中108例（29.51%）A、B兩種試劑均低于檢測(cè)下限，124例（33.88%）試劑B低于檢測(cè)下限而試劑A高于檢測(cè)下限（包括24例超過(guò)1.00×103 IU/mL，考慮試劑B為假陰性），134例（36.61%）檢測(cè)結(jié)果均高于兩種方法的檢測(cè)下限。試劑A的陽(yáng)性率為70.49%，試劑B的陽(yáng)性率為36.61%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=84.45，P<0.01）。

2.2兩種試劑HBV-DNA檢測(cè)值的比較及影響因素

全部患者試劑A的HBV-DNA檢測(cè)均值為（2.85±2.57）Log10 IU/mL，試劑B的HBV-DNA檢測(cè)均值為（1.89±2.67）Log10 IU/mL，試劑A的檢測(cè)均值顯著高于試劑B（t=12.47，P<0.01）。試劑A的檢測(cè)值高于試劑B 204例（A組），試劑B的檢測(cè)值高于試劑A 46例（B組，其中4例試劑A的檢測(cè)值報(bào)告形式>1.70×108 IU/mL故予以剔除），其余112例試劑A、B的檢測(cè)值相同（包括108例A、B兩種試劑均低于檢測(cè)下限、4例檢測(cè)值完全一致）；組別A和B的HBeAg滴度、終末期患者比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=1305.00、χ2=6.42，P<0.05），而性別比例、年齡和ALT水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.31，t=1.07，U=4350.00，P>0.05），見(jiàn)表1。

2.3兩種試劑的相關(guān)性分析

以試劑A為標(biāo)準(zhǔn)，Spearman相關(guān)分析顯示，1.00×103 IU/mL0.70），見(jiàn)表2。

3討論

傳統(tǒng)的HBV血清標(biāo)志物如HBsAg、HBeAg等是病毒感染和復(fù)制的間接指標(biāo)，但其受病毒變異、患者免疫狀態(tài)等多種因素的影響，而血清HBV-DNA定量則更為直接，可以反映患者體內(nèi)病毒復(fù)制活動(dòng)情況。血清HBV-DNA的檢測(cè)一般基于熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（PCR），該技術(shù)自上世紀(jì)80年代逐步發(fā)展起來(lái)，具有敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易于自動(dòng)化、定量范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)有多個(gè)品牌的PCR試劑盒，但諸如核酸的提取、標(biāo)本的狀態(tài)、退火溫度、引物的設(shè)計(jì)等均沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化[6]，故檢測(cè)結(jié)果之間存在差異。COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)試劑盒由美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)，由于增加進(jìn)入檢測(cè)體系的樣品容積（達(dá)到650 μL，遠(yuǎn)高于國(guó)產(chǎn)試劑盒的50～100 μL）可以顯著提高敏感度、采用全自動(dòng)的核酸提取系統(tǒng)并通過(guò)磁珠吸附法純化可以有效提取核酸、設(shè)置了內(nèi)參故可以有效彌補(bǔ)標(biāo)本間核酸提取效率的差異及反應(yīng)體系中可能存在的抑制物質(zhì)的影響、采取多對(duì)覆蓋高變區(qū)的引物探針可以避免由于病毒變異導(dǎo)致的假陰性，故一般認(rèn)為其靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性等較國(guó)產(chǎn)試劑更好[3-4，7-8]。

本研究結(jié)果表明，COBAS系統(tǒng)有更靈敏的檢測(cè)下限，血清HBV-DNA的最小準(zhǔn)確檢測(cè)值可達(dá)20.93 IU/mL，但其檢測(cè)上限（1.70×108 IU/mL）稍遜于國(guó)產(chǎn)試劑（5.62×108 IU/mL），與既往的報(bào)道基本一致[9-10]。而且共366例患者中有124例（33.88%）出現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果明顯不一致，全都為國(guó)產(chǎn)試劑低于檢測(cè)下限而COBAS系統(tǒng)高于檢測(cè)下限。邵國(guó)輝等[11]分析了112份經(jīng)國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)下限的擬停藥乙肝患者血清標(biāo)本，經(jīng)COBAS系統(tǒng)再次檢測(cè)有72例（64.29%）高于高靈敏度HBV-DNA檢測(cè)下限（20 IU/mL），與本研究的結(jié)論基本相似（甚至有更高的比例）。需要指出的是，本研究中還有24例患者超過(guò)1.00×103 IU/mL，而這些患者可能為國(guó)產(chǎn)試劑假陰性的表現(xiàn)。陳占國(guó)等[12]認(rèn)為由于近年來(lái)抗病毒藥物的廣泛使用，由于病毒變異導(dǎo)致試劑對(duì)突變的HBV存在檢測(cè)盲區(qū)或效率低下，出現(xiàn)假陰性的概率逐年增加，這在一定程度上解釋了本文的分析結(jié)果。因此，COBAS系統(tǒng)檢測(cè)HBV-DNA的陽(yáng)性率也顯著高于國(guó)產(chǎn)試劑，張玥等[13]也有類似的報(bào)道。故在臨床實(shí)際工作中，對(duì)于那些慢性HBV感染患者多次國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)血清HBV-DNA<1.00×103 IU/mL而無(wú)明確其他肝損原因、接受抗病毒治療后血清HBV-DNA長(zhǎng)期<1.00×103 IU/mL，但血清ALT、AST持續(xù)異常者均有必要采用COBAS系統(tǒng)予以復(fù)查確認(rèn)病毒的真正復(fù)制狀態(tài)并排除由于試劑原因?qū)е碌募訇幮浴?

臨床上，HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果的假陰性會(huì)延誤部分患者的抗HBV治療的時(shí)機(jī)。對(duì)失代償期肝硬化患者抗病毒治療，我國(guó)指南提出只要HBV-DNA可檢測(cè)到，就可應(yīng)用核苷（酸）類似物進(jìn)行治療，與2009年版AASLD指南的觀點(diǎn)一致[1，14]。另外《慢性乙型肝炎抗病毒治療專家共識(shí)》指出[15]，對(duì)年齡超過(guò)40歲或有肝硬化、肝細(xì)胞癌家族史的慢乙肝患者，也有同樣的建議。但因應(yīng)用國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)下限HBV-DNA<1.00×103 IU/mL，將導(dǎo)致一部分患者不能得到及時(shí)治療。本研究證實(shí)了這一點(diǎn)，以1.00×103 IU/mL作為HBV-DNA檢測(cè)下限，將有27.32%（100/366）的患者不能得到及時(shí)的抗病毒治療，這將增加該部分患者病情進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。

進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，COBAS系統(tǒng)的血清HBV-DNA檢測(cè)均值顯著高于國(guó)產(chǎn)試劑，通過(guò)配對(duì)比較發(fā)現(xiàn)366例患者中，204例試劑A的檢測(cè)值高于試劑B，只有50例試劑B的檢測(cè)值高于試劑A，與部分學(xué)者[9，16]的觀點(diǎn)基本一致，表明COBAS系統(tǒng)的平均擴(kuò)增效率優(yōu)于國(guó)產(chǎn)試劑，且本研究還發(fā)現(xiàn)HBeAg滴度低者、終末期肝病患者更容易出現(xiàn)COBAS系統(tǒng)的血清HBV-DNA檢測(cè)值高于國(guó)產(chǎn)試劑的情況，其中緣由可能與此類患者體內(nèi)乙肝病毒變異率高有關(guān)，故此時(shí)宜選用COBAS系統(tǒng)檢測(cè)血清HBV-DNA方可更準(zhǔn)確地反應(yīng)機(jī)體內(nèi)病毒復(fù)制情況。

兩種試劑的相關(guān)性分析表明，在HBV-DNA<1.00×103 IU/mL時(shí)相關(guān)性較差，與倪俊明等[17-19]研究結(jié)果一致，這可能與部分患者在低病毒載量時(shí)國(guó)產(chǎn)試劑難以檢測(cè)出病毒復(fù)制水平有關(guān)；而在高水平復(fù)制狀態(tài)時(shí)（>1.00×107 IU/mL）由于COBAS系統(tǒng)的檢測(cè)上限限制，兩種試劑的相關(guān)性也較差。但在1.00×103 IU/mL

總之，國(guó)產(chǎn)PCR試劑可以用于抗病毒治療的隨訪、監(jiān)測(cè)，基本滿足臨床的需求，但其靈敏性、準(zhǔn)確性相較COBAS系統(tǒng)仍有差距，特別是針對(duì)那些懷疑有低病毒復(fù)制狀態(tài)或病毒變異導(dǎo)致國(guó)產(chǎn)PCR試劑假陰性的患者，更有必要用COBAS系統(tǒng)予以復(fù)核。同時(shí)，由于本文病例的選擇并非完全隨機(jī)，故確切結(jié)論仍需大樣本、多中心的數(shù)據(jù)予以驗(yàn)證。

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（收稿日期：2017-08-11）