不同中醫(yī)證型中潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血清IL-6和IL-23表達(dá)研究

曹 蛟，劉文奇，李 舒，楊曉航*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，咸陽 712046 ；2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430072 ）

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病中的一種，其病因不明確，主要與遺傳因素、免疫因素和環(huán)境因素有關(guān)，病變?yōu)闇\表性和非特異性炎癥，乙狀結(jié)腸受累最明顯[1]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-23（interleukin-23，IL-23）是一些疾病炎癥反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子[2]。Allocca[3]認(rèn)為IL-6與IBD以及其他慢性炎癥性疾病和癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的重要細(xì)胞因子。IL-23在UC的發(fā)生、發(fā)展中具有非常重要的作用，它主要由活化的單核巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生。能促進(jìn)T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ和IL-12 ，與炎癥反應(yīng)疾病密切相關(guān)[4]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-6 和 IL-23 在黏膜表達(dá)水平可反映 UC 疾病活動(dòng)度[5]。

虛實(shí)辨證是中醫(yī)八綱辨證的重要內(nèi)容，也是中醫(yī)臨床以“病位”和“病性”確立證候分類的基本原則。因此闡明疾病虛實(shí)證候形成的物質(zhì)基礎(chǔ)和發(fā)病的分子病理機(jī)制，對于中醫(yī)證候本質(zhì)研究、 疾病臨床治療具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)旨在研究IL-6和IL-23分別在UC不同中醫(yī)證型患者中的差異，為中醫(yī)虛實(shí)辨證UC提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2013年1月－2014年12月在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院治療的UC患者31例，健康對照組6例。參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識(shí)意見》[6]中的標(biāo)準(zhǔn)將患者分為濕熱內(nèi)蘊(yùn)證7例，年齡（47.5±24.5）歲，男5例，女2例；脾胃氣虛證14例，年齡（48±23）歲，男9例，女6例；脾虛濕熱證10例，年齡（49.5±13.5）歲，男4例，女6例。另設(shè)立健康對照組6例，年齡（31±7）歲，男5例，女1例。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各組性別、年齡構(gòu)成無明顯差異（P＞0.05）。

納入臨床采集受試者入選標(biāo)準(zhǔn)：1）符合UC的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；2）符合中醫(yī)脾胃氣虛證、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證和脾虛濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)；3）年齡在18～55歲之間；4）近一個(gè)月內(nèi)無腸道感染疾?。?）近一個(gè)月內(nèi)未使用抗生素及益生菌制劑；6）患者自愿簽署知情同意書；7）采樣過程符合倫理委員會(huì)要求。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1）UC的其他中醫(yī)證候者；2）合并有代謝性疾病，如糖尿病、高血脂、高血壓、肥胖、代謝綜合征等；3）有嚴(yán)重的并發(fā)癥，如局部狹窄、腸梗阻、腸穿孔、中毒性結(jié)腸擴(kuò)張、結(jié)腸癌、直腸癌及肛門疾病者；4）妊娠及哺乳期婦女；5）過敏體質(zhì)及對多種藥物過敏者；6）合并肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)病及精神病患者；7）病情危重，研究者判斷無法堅(jiān)持中醫(yī)治療者。

試劑及儀器：IL-6、IL-23檢測ELISA試劑盒購自美國Immunoway公司；美國BioTek 公司ELx808酶標(biāo)儀；科大創(chuàng)新有限公司KDC-40低速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 病例收集 根據(jù)《潰瘍性結(jié)腸炎臨床診斷指南》[7]標(biāo)準(zhǔn)，收集UC病例，并進(jìn)行臨床調(diào)查?；颊唛喿x簽定知情同意書，確定入選排除標(biāo)準(zhǔn)，填寫基本信息、中醫(yī)癥狀評(píng)分表、既往史、治療史、合并疾病和用藥情況。對入選患者做相關(guān)檢查，對安全指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識(shí)意見》[6]將入選的31例患者進(jìn)行辨證分型，其過程由專人（附屬醫(yī)院兩位主治醫(yī)師）進(jìn)行質(zhì)控和辨證分型。另入選健康成人6例作為對照組。

1.2.2 IL-6、IL-23檢測 采集患者清晨空腹肘靜脈血約5 mL，室溫靜置10 min，3 000 r/min離心10 min。小心抽取血清后立即凍存于-80℃冰箱，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別測定IL-6和IL-23水平。1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟 1）稀釋標(biāo)準(zhǔn)品從2000 pg/mL到0 pg/mL放入特定的離心管中。充分混勻幾次或者輕輕振蕩。向96孔板中每孔加入100 uL的已經(jīng)稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育2 h。樣本按照順序用Assay Dliuent加以稀釋，稀釋到可以檢測的濃度范圍。然后每孔加入100 uL。2）檢測抗體加入已包被的一抗吸出標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，每孔加入300～400 uL 1×wash bu f fer，振蕩沖洗3～4次。將稀釋detection antibody solution檢測抗體溶液（1:200稀釋）；Assay diluent，至濃度為0.4 ug/mL，充分混勻。每孔加入100 uL已經(jīng)稀釋過的detection antibody solution。密封96孔板，室溫孵育2 h。3）鏈霉親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合的生物素標(biāo)記的檢測抗體。①將detection antibody solution吸出96孔板，洗板4次；②用Assay diluent將400×的streptavidin-HRP稀釋，按照1:400的比例，稀釋成1×的streptavidin-HRP solution。每孔加入100 uL室溫孵育30 min。4）液體底物顯色反應(yīng)的應(yīng)用，吸出1×streptavidin-HRP solution，板洗4次。每孔加入100 uL的ready –to –use substrate（底物）室溫孵育直至變色,避光。變色過程終止，迅速每孔加入100 uL的終止液，30 min后移至酶標(biāo)儀檢測吸光度，波長范圍在540 nm-570 nm之間。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組樣本均數(shù)之間比較，采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示。以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在31例UC患者中，IL-6表達(dá)水平對照組與脾胃氣虛組比較P＜0.05。而對照組、濕熱內(nèi)蘊(yùn)組、脾虛濕熱組之間比較均無顯著差異P＞0.05。IL-23表達(dá)水平對照組與濕熱內(nèi)蘊(yùn)組、脾胃氣虛組、脾虛濕熱組之間比較P＜0.01。濕熱內(nèi)蘊(yùn)組與脾胃氣虛、脾虛濕熱組比較P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；脾胃氣虛組與脾虛濕熱組之間比較P＞0.05，兩者之間無差異性，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（見表1）。

表1 31例不同中醫(yī)證型UC患者外周血清IL-6和IL-23表達(dá)情況（x±s）

2.2 在UC患者中，3種中醫(yī)證候中IL-6和IL-23表達(dá)水平均高于對照組。同一種細(xì)胞因子中，不同中醫(yī)證候之間白介素表達(dá)水平不同。不同細(xì)胞因子中，脾胃氣虛組表達(dá)水平最高，其次是脾虛濕熱組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)組（見圖1所示）。

圖1 31例不同中醫(yī)證型UC患者外周血清IL-6和IL-23表達(dá)情況（均值）

3 討論

炎性細(xì)胞因子在腸炎發(fā)病過程中扮演著重要的角色，現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，白介素在UC的發(fā)病中關(guān)系尤為密切，可作為判斷UC治療和預(yù)后的生物指標(biāo)之一[8]。Gerlach[9]認(rèn)為IL-9參與調(diào)節(jié)腸道屏障功能，改變腸道的滲透性。IL-23能促進(jìn)Th17細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子IL-17，參與多種慢性炎癥性疾病，而IL-17在UC腸道黏膜上的高表達(dá)與疾病的活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)[10]。Geremia A[11]研究表明，IL-23也作用于固有免疫系統(tǒng)，有助于炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和組織炎癥細(xì)胞。有學(xué)者對UC患者血清與健康血清IL-23水平進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)IL-23對潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[12]。Mirsattari D[13]表明血清IL-23表達(dá)水平與潰瘍性結(jié)腸炎的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度是直接相關(guān)的。而Taka B[14]研究發(fā)現(xiàn)IL-6 與炎性細(xì)胞信號(hào)通路關(guān)系密切。IL-6可直接抑制炎性細(xì)胞凋亡，促進(jìn)炎性細(xì)胞過度分泌[15]。王少鑫等[16]表明IL-6表達(dá)失衡與UC的病情進(jìn)展相關(guān)。周勇[17]亦表明IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)水平可直接反映出UC患者的病情程度。因此,大量的國內(nèi)外文獻(xiàn)表明潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病及嚴(yán)重程度與白介素表達(dá)水平密不可分。

不同中醫(yī)證候虛實(shí)之間，白介素的表達(dá)水平亦有差異。殷銀霞等[18]在對脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清及組織中的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，脾腎陽虛型的大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的表達(dá)水平較空白組明顯升高。楊立春等[19]對臨床180例UC患者研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)證患者血清中IL-6、IL-8表達(dá)水平比虛證、虛實(shí)夾雜證高；UC患者活動(dòng)期IL- 6、IL-8水平較緩解期高，這對中醫(yī)辨證分型有一定的參考價(jià)值。李麗萍[20]對臨床196例UC患者研究發(fā)現(xiàn)，虛證患者的IL-4表達(dá)水平明顯低于實(shí)證患者。劉紅芬等[21]對77例活動(dòng)期不同中醫(yī)證型UC患者中發(fā)現(xiàn)實(shí)證患者IFN-γ表達(dá)水平顯著高于虛證患者，而IL-4表達(dá)水平確顯著低于虛證患者。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-23表達(dá)水平中，對照組與濕熱內(nèi)蘊(yùn)組、脾胃氣虛組、脾虛濕熱組之間比較P＜0.01。濕熱內(nèi)蘊(yùn)組與脾胃氣虛、脾虛濕熱組比較P＜0.05。脾胃氣虛組與脾虛濕熱組之間比較P＞0.05。IL-6表達(dá)水平對照組與脾胃氣虛組比較P＜0.05。而對照組、濕熱內(nèi)蘊(yùn)組、脾虛濕熱組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05，但這并不能說明濕熱內(nèi)蘊(yùn)組和脾虛濕熱組中IL-6的表達(dá)水平與UC無關(guān)?？赡芘c各樣本數(shù)量、性別及年齡比例等因素有關(guān)。另外對IL- 6和IL-23表達(dá)水平和各證候進(jìn)行分別比較發(fā)現(xiàn)，脾胃氣虛組的白介素表達(dá)水平最高，其次是脾虛濕熱組和濕熱內(nèi)蘊(yùn)組。這可對UC的臨床辨證分型中有一定的參考價(jià)值。

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