細胞焦亡在慢性肝臟疾病中作用的研究進展

楊 祥，開 鈞，王志敏，張晨曦，邵江娟，張 峰，鄭仕中

(南京中醫(yī)藥大學1.藥學院、2.江蘇省中藥藥效和安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

隨著生活水平的提高，人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，作為人體最大的代謝器官肝臟發(fā)生病變的幾率也逐漸增大。慢性肝病患者首先發(fā)生肝細胞脂肪變性，并伴隨著炎癥的發(fā)生，進而發(fā)展為肝纖維化，肝臟形成代償性瘢痕組織，更嚴重的形成肝硬化，甚至發(fā)展為肝癌，最終造成患者的死亡[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡廣泛存在于慢性肝臟疾病發(fā)生過程中，抑制多種肝臟細胞焦亡的發(fā)生可以降低肝損傷時肝細胞的損傷程度，減少炎癥因子的生成和炎癥反應[2-3]。除此之外，焦亡細胞產(chǎn)生的炎癥因子IL-1β能夠誘導肝星狀細胞活化，對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有著促進作用[4-5]。因此，細胞焦亡在非酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪肝病、病毒性肝炎、肝纖維化、肝癌等肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用，本文總結(jié)了多種類型細胞焦亡在慢性肝臟疾病中的作用，為治療慢性肝臟疾病提供新的思路和方法。

1 細胞焦亡

焦亡是細胞程序性死亡中一種炎癥性死亡形式，焦亡與凋亡存在著明顯差異，凋亡的發(fā)生主要依賴于半胱天冬酶caspase-3、6、8等，伴隨著凋亡小體形成，細胞內(nèi)容物由細胞膜包裹，而后由巨噬細胞對其進行非炎癥性吞噬。而焦亡則依賴于半胱天冬酶caspase-1、4、5、11，過程中細胞脂質(zhì)雙分子層膜上形成孔腔，細胞破裂，胞內(nèi)炎性物質(zhì)釋放誘發(fā)局部炎癥反應。細胞焦亡是一種由各種各樣的刺激，包括入侵的細菌、細胞內(nèi)病原體等引發(fā)的機體自身防御機制。其中脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)作為細菌的重要生成物，不僅能夠刺激機體產(chǎn)生免疫反應，也是誘導細胞發(fā)生焦亡的重要因子[6]。正常情況下，焦亡是一種有利于機體的適應性免疫反應，從宿主體內(nèi)清除細胞內(nèi)的病原體，將感染性細菌呈遞給中性粒細胞等免疫細胞，免疫細胞通過釋放的細胞因子殺傷感染性細菌和細胞內(nèi)病原體，而焦亡的過度激活則會導致細胞大量死亡、組織損傷、器官衰竭和致命的敗血性休克[7]。

1.1經(jīng)典炎癥小體介導的細胞焦亡細胞主要通過經(jīng)典炎癥小體通路來誘導自身焦亡。炎癥小體通常是由Nod樣受體(nod like receptor, NLR)、適配器蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和pro-caspase-1所構(gòu)成的小分子多蛋白復合物[8]。適配器蛋白ASC含有caspase 募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain, CARD)和熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain, PYD)，能夠作為雙重接頭蛋白分子，通過CARD-CARD和PYD-PYD 相互作用，將含有PYD結(jié)構(gòu)域的NLR與含有CARD結(jié)構(gòu)域的pro-caspase-1連接起來，二聚體形式的pro-caspase-1裂解為p10、p20 亞單位，形成具有催化活性的caspase-1，誘導IL-1β和IL-18的成熟，從而介導細胞焦亡的發(fā)生。已知能夠形成炎癥小體的NLR家族成員有NLRC4、NLRP1、NLRP3以及AIM2。微生物的特殊結(jié)構(gòu)作為病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，以及損傷的宿主細胞通過釋放損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，誘導細胞內(nèi)炎癥小體的形成[9]。經(jīng)典炎癥小體的形成是焦亡過程中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，影響炎癥小體的組裝與活化能夠作為調(diào)控細胞焦亡的重要方式。

1.2非經(jīng)典炎癥小體介導的細胞焦亡近年來，非經(jīng)典炎癥小體因為其獨特的形成方式而區(qū)別于其他經(jīng)典炎癥小體。革蘭陰性菌通過形成外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMV)，將LPS遞送到細胞表面，通過細胞內(nèi)吞作用將LPS包裹在內(nèi)涵體中進入細胞，LPS在細胞中釋放，促進caspase-11的活化[10]。在小鼠體內(nèi)，pro-caspase-11與LPS尾部的脂質(zhì)體A通過直接的相互作用結(jié)合在一起，而人體中，作為caspase-11同源體的caspase-4/5也是通過相似的方式，直接與細胞內(nèi)的LPS相互作用形成非經(jīng)典炎癥小體，從而促使細胞發(fā)生焦亡[11]。

1.3GSDMD介導的細胞焦亡炎癥小體發(fā)現(xiàn)后，它們是如何誘導細胞焦亡的機制依舊不清楚，人們逐漸將目光集中在其下游的目標靶點。Kayagaki等[12]和Shi等[13]幾乎在同一時間確定了GSDMD是caspase-11下游的底物蛋白。GSDMD屬于一個被稱為gasdermin的功能未知的蛋白家族，該家族還包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、DFNB59(GSDME)等。GSDMD在caspase-11的保守域D276被分割成一個N末端p30(GSDMD-N結(jié)構(gòu)域)和一個C末端p20(GSDMD-C結(jié)構(gòu)域)。GSDMD-N能夠特異地結(jié)合磷酸化磷脂酰肌醇或心磷脂，而這兩種物質(zhì)分別是真核細胞和原核細胞膜上特有的磷脂。GSDMD-N分子通過這種方式結(jié)合到細胞膜，隨后發(fā)生寡聚化，16個該分子形成內(nèi)徑約為10～14 nm的孔道[14]。炎癥小體通路產(chǎn)生的炎癥因子IL-1β和IL-18，以及K+，通過這一孔道分泌到細胞外，同時Ca2+大量流入，造成滲透壓和電化學梯度，細胞外的水大量進入細胞，造成細胞破裂死亡。因為GSDMD-N蛋白在細胞膜上形成的孔道在細胞焦亡中發(fā)揮的重要作用，成為一種關(guān)鍵蛋白，調(diào)控著細胞焦亡的進程。

2 細胞焦亡與肝臟疾病

人體肝臟是由肝臟實質(zhì)細胞(肝細胞)和非實質(zhì)細胞(non-parenchymal cells, NPCs)構(gòu)成，其中非實質(zhì)細胞主要包括肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)、枯否細胞(Kupffer cells，KCs)、肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSECs)、中性粒細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)等，肝臟發(fā)生疾病時，往往伴隨著多種細胞的病理性變化。近年來，焦亡作為新的細胞程序性死亡方式，因為其特殊的病理特征越來越受到人們的關(guān)注。細胞焦亡主要是由于細菌產(chǎn)生的LPS誘導發(fā)生，人體胃腸道中存在有大量的細菌，通過肝腸軸對肝臟產(chǎn)生重要影響。不健康的飲食方式，尤其是長期酗酒和高脂飲食，往往會造成腸道菌群的失衡，細菌通過血液到達肝臟，并誘導肝臟組織發(fā)生病變。正常狀態(tài)下，焦亡過程中所必需的炎癥小體主要存在于肝臟KCs、LSECs中，部分存在于門靜脈竇周圍的肌成纖維細胞和HSCs中，而在肝細胞中幾乎不存在。但在LPS的刺激后，肝臟HSCs和肝細胞中出現(xiàn)大量活化的炎癥小體[15]。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟KCs、中性粒細胞、DCs和肝細胞都能發(fā)生焦亡。焦亡細胞分泌的IL-1β和IL-18可以誘導炎癥反應，造成肝臟損傷，其中 IL-1β 不僅能夠影響IL-1R1，JNK和AP-1 通路，提高HSCs的增殖能力[5]，還可以直接誘導肝細胞脂肪變性，增強肝細胞炎癥反應[16]。炎癥小體作為胞內(nèi)物質(zhì)被釋放到細胞外，能夠活化存在于細胞外間隙的 caspase-1 前體，周圍正常的巨噬細胞通過內(nèi)化這些游離的炎癥小體，促進胞內(nèi)caspase-1的活化[17]，表現(xiàn)為細胞之間焦亡的相互影響。另外，通過體內(nèi)特異性敲除GSDMD，有利于緩解慢性肝臟疾病中肝組織的脂肪變性和炎癥反應[18]。因此，炎癥小體以及GSDMD介導的細胞焦亡可能在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

2.1細胞焦亡與非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD) NAFLD是指除酒精和其他明確的肝損傷因素外，所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，其范圍包括早期的單純脂肪變性、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)，以及發(fā)展形成的肝纖維化、肝硬化和肝癌。肝細胞死亡能夠引發(fā)細胞炎性反應，因此，減少肝細胞死亡有利于緩解脂肪肝病的進展。焦亡作為細胞一種炎癥相關(guān)的程序性死亡方式，有效地抑制其在肝臟中發(fā)揮的作用可能成為NAFLD潛在的治療方式。

Xu等[18]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生NAFLD/NASH的人類肝臟組織中，GSDMD和焦亡過程中誘導的GSDMD-N蛋白表達明顯升高。蛋氨酸/膽堿缺乏飲食(methionine/choline deficient diet, MCD)方式喂養(yǎng)的GSDMD-/-小鼠與野生小鼠相比，表現(xiàn)出脂肪變性和炎癥程度明顯降低，并且脂肪生成基因SREBP-1c表達減少，脂肪降解基因PPARα、ACO、LCAD、Cyp4a10和 Cyp4a14表達增加；體外實驗，在AML-12肝細胞中過表達GSDMD-N，肝細胞在MCD處理后的損傷程度增加。GSDMD在NASH病理過程中控制著IL-1β、TNF-α和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)等細胞因子的釋放，以及NF-κB的活化和脂肪生成。MCC950作為一種NLRP3選擇性抑制劑，能夠抑制膽固醇晶體介導的KCs、骨髓來源的巨噬細胞NLRP3活化，阻止MCD模型中肝臟caspase-1和IL-1β的增加，降低巨噬細胞和中性粒細胞的數(shù)量，達到改善肝纖維化的作用。NLRP3-/-小鼠的MCD模型與野生型小鼠相比較，非酒精性肝炎的程度更低[2]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)與NLRP3在NASH過程中形成復合物，TXNIP缺乏能夠促進NLRP3炎癥小體的活化。由此，推斷TXNIP結(jié)合抑制NLRP3活化，起到抗炎和保護細胞的作用[3]。此外，小分子化合物AS-1通過抑制ASC和NLR的結(jié)合來阻礙炎癥小體的形成，也具有減緩NASH和肝臟胰島素抵抗的作用[19]。

由此可見，抑制炎性小體復合物的合成與活化過程，或者減少焦亡過程中的關(guān)鍵蛋白GSDMD的表達來抑制焦亡的發(fā)生，能夠減弱肝臟細胞焦亡后引起的肝臟炎癥反應、組織損傷和脂肪變性的現(xiàn)象，具有一定減緩NAFLD的作用。

2.2細胞焦亡與酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD) ALD是全世界慢性肝病和導致肝纖維化、肝硬化的一個主要誘因。ALD包括酒精性脂肪肝炎(alcoholic steatohepatitis, ASH)、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis, AH)、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化。酒精導致的肝臟損傷機制錯綜復雜，其中包括酒精代謝產(chǎn)物乙醛毒性、氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥反應等等，而焦亡發(fā)生時常常伴隨著肝臟局部炎癥反應，同時，肝細胞能夠通過促炎因子IL-1β和IL-18，與各種免疫細胞產(chǎn)生細胞間的交流，對肝臟ALD的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響[20]。

Khanova等[21]在探究ASH轉(zhuǎn)化為AH的過程中，發(fā)現(xiàn)在小鼠和人體AH肝臟中，非經(jīng)典炎癥小體caspase 11/4表達上調(diào)，caspase 11/4在完成切割后，使GSDMD活化，并誘導細胞焦亡以應對細胞內(nèi)PAMPs。而在AH模型中，直接在肝細胞中過表達成熟的GSDMD，能夠增加肝細胞死亡數(shù)量和炎性細胞浸潤。結(jié)果表明，caspase 11/4-GSDMD信號通路誘導的肝細胞焦亡在ASH轉(zhuǎn)化為AH的病理過程中具有重要作用。實驗還發(fā)現(xiàn)[16]，致病劑量的IL-1β能夠誘導肝細胞脂肪變性，增強肝細胞炎癥反應，增加MCP-1的表達。ALD伴隨著脂肪變性和促炎性因子的上調(diào)，其中炎癥因子IL-1β也是細胞焦亡重要產(chǎn)物。炎癥因子不僅會誘發(fā)焦亡細胞自身炎癥反應，還可以對周圍正常細胞產(chǎn)生影響，形成一個惡性循環(huán)。因此，通過抑制炎癥小體的形成和GSDMD的表達，減少肝臟細胞的焦亡，能夠減輕酒精誘導的肝臟炎癥反應、脂肪變性和組織損傷。

2.3細胞焦亡與病毒性肝炎病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的肝臟傳染性疾病，嚴重的病毒性肝炎也會發(fā)展成肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌。研究發(fā)現(xiàn)，KCs在LPS刺激后表達大量的NLRP3和成熟的IL-1β，而慢性HBV感染能夠抑制LPS誘導的NLRP3和IL-1β的表達及IL-1β的成熟，該過程涉及到NF-κB信號通路的抑制和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生[22]。Kofahi等[23]探究HCV感染是如何導致肝臟衰竭時，檢測HCV感染Huh-7.5細胞后誘導的細胞程序性死亡方式，發(fā)現(xiàn)HCV不僅能夠誘導caspase-3介導的凋亡，還可以誘導caspase-1介導的細胞焦亡，且這兩種程序性死亡的發(fā)生不僅僅局限于受感染的細胞，也能夠影響周圍正常細胞，誘導它們發(fā)生凋亡或焦亡。進一步研究HCV與肝臟細胞焦亡關(guān)系，能夠增加人們對肝炎病毒誘導肝臟疾病產(chǎn)生機制的認識。

2.4細胞焦亡與肝纖維化肝纖維化是指在肝臟受到外來刺激時，存在于肝組織Disse間隙中的HSCs活化增殖，并分泌大量的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，ECM合成和降解失衡，導致肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積而形成瘢痕組織的一種代償性疾病。肝纖維化也是NAFLD、ALD、肝硬化及肝癌共同的病理過程。研究表明，炎癥小體的活化能夠?qū)е赂渭毎慕雇?，并能進一步誘發(fā)肝臟炎癥和肝纖維化[24]。

肝組織損傷時，壞死的肝細胞能夠募集嗜酸粒細胞，導致其分泌IL-1β和IL-18，甚至死亡，同時進一步誘發(fā)肝細胞的死亡、周圍組織炎癥和肝纖維化的產(chǎn)生與發(fā)展，而這一過程可以通過caspase-1抑制劑來抵消，表明浸潤的嗜酸粒細胞通過發(fā)生焦亡對肝細胞產(chǎn)生影響，并且能夠誘導肝纖維化的發(fā)生。體外實驗中，LPS刺激的巨噬細胞RAW 264.7通過旁分泌IL-1β、IL-18和TNF-α，促進LX-2細胞中pro-IL-1β的形成和切割，并且誘導小鼠HSCs的活化和膠原蛋白的形成[25]。此外，分別將GSDMD-/-和WT小鼠用MCD方式飼養(yǎng)8周，誘導肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)WT組小鼠肝臟中α-SMA和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)mRNA水平更高，GSDMD-/-小鼠肝臟羥脯氨酸含量明顯減少，表明GSDMD對MCD誘導的肝纖維化的發(fā)展具有重要作用[18]。

HSCs中存在少量的炎癥小體，有研究表明，抑制HSCs中炎癥小體的形成能夠下調(diào)HSCs活化時重要指標膠原蛋白和α-SMA含量，以及ECM的形成與沉積[26]，但其自身能否發(fā)生焦亡還需要進一步研究?；罨腍SCs分泌大量的ECM是導致肝纖維化的重要原因，肝細胞及Disse間隙中非實質(zhì)細胞發(fā)生的異常焦亡可能對HSC的活化產(chǎn)生促進作用。因此，進一步探究肝臟細胞焦亡產(chǎn)生的具體影響，對研究肝纖維化進程與發(fā)展具有重要意義。

2.5細胞焦亡與肝癌肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤疾病之一，通常是繼發(fā)于慢性肝臟疾病。靶向介導肝癌細胞的死亡一直是治療肝癌的重要手段，焦亡作為一種新的細胞程序性死亡方式，可能是繼細胞衰老、凋亡后新的治療肝癌的方法。與正常肝臟組織相比較，在肝癌發(fā)展的不同階段，肝癌組織中NLRP3的表達明顯變低[27]，意味著肝癌細胞發(fā)生焦亡的可能性降低。最近還發(fā)現(xiàn)，GSDME(DFNA 5)能夠?qū)NF-α或者是化學藥物誘導的細胞凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡，并且GSDME在絕大多數(shù)腫瘤細胞中是沉默的，而在正常肝臟中表達[28]。因此，進一步研究細胞焦亡，對肝臟腫瘤的預防和治療具有重要意義。

3 結(jié)語

肝臟作為人體最重要的器官之一，長期酗酒以及不健康的飲食和生活方式會導致NAFLD、ALD的發(fā)生，加上全球病毒性肝炎的日益蔓延，肝臟的健康受到了極大的挑戰(zhàn)。如果缺乏有效的干預治療，慢性肝病由早期的纖維化會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不踔潦歉伟?，直接威脅患者的生命。肝臟疾病發(fā)生時伴隨著炎癥小體的激活和炎性介質(zhì)IL-1β和IL-18的釋放，以及GSDMD的表達增加。焦亡作為一種炎性相關(guān)的程序性死亡方式，主要通過PAMPs或者DAMPs方式，激活caspase-1/4/5/11相關(guān)的炎性小體，并促使GSDMD-N生成，誘導細胞的脹破，細胞內(nèi)容物及炎性介質(zhì)釋放。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肝臟中KCs、DCs、中性粒細胞等免疫細胞和肝細胞均能發(fā)生焦亡。正常生理狀況下，焦亡作為機體免疫的一部分，具有呈遞和吞噬病原體的積極作用，而過度的細胞焦亡則會導致大量細胞死亡，對肝臟組織生理結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生破壞。焦亡細胞分泌的物質(zhì)通過細胞之間的交流，影響著周圍正常細胞，其中IL-1β誘導的HSCs大量活化將直接加快肝纖維化的進程，對慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展具有促進作用。然而，目前細胞焦亡調(diào)控肝臟疾病的機制尚不清楚，還需要我們進一步研究，該領(lǐng)域的探索能夠為預防和治療慢性肝臟疾病提供新的方法和策略。